论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是所有国家公共的卫生问题,已有2亿多人被影响。虽然从1982年就有高效的乙肝病毒疫苗,可是仍有4.0多亿慢性携带者,而且其中75%的携带者在亚洲太平洋地区。慢性HBV感染导致的肝炎后肝硬化和肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等终末期肝病,目前已成为危害中国人民生命健康的主要疾病。近些年来虽然有新型抗HBV药物不断出现,但是其疗效不尽如人意,仍然需要探索新型的抗HBV的治疗方法。α干扰素是抗HBV药物之一,然而有相当部分病人无应答。这些无应答的患者中α干扰素不敏感的机制是难以捉摸的。在前期研究中我们发现预测慢性乙型肝炎患者α干扰素治疗前的肝组织中一些干扰素刺激基因的表达增加与α干扰素治疗无应答组有关。因此,深入了解RNAi抑制泛素特异性肽酶(ubiquitin specific peptidase18,USP18)的表达以及调控具有重要的意义。目的：应用RNA干扰技术构建重组USP18 RNAi慢病毒,并且筛选出最有显著抑制USP18表达的重组RNAi慢病毒；然后转染HepG2.2.15细胞后观察HBV DNA及干扰素敏感基因15(IFN-sensitive gene,ISG15)的表达。方法：在本研究中,我们在体外化学合成针对USP18基因的三个靶点siRNAJ序列(siRNA1,siRNA2,siRNA3),以慢病毒载体介导下构建重组USP18 RNAi慢病毒,转染HepG2.2.15细胞5天后,实时定量PCR (RT-PCR)检测USP18 mRNA的表达水平,从中筛选抑制率最高的重组USP18 RNAi慢病毒；然后再转染HepG2.2.15细胞时加入长效聚乙二醇干扰素(Pegylated interferon alfa-2a,PEG-IFNα),分五组,AN和B组为重组siRNA慢病毒转染组,C组和D组为未转染组,E组为空白组；其中,A组和C组培养于含有PEG-IFNα、含10%胎牛血清的MEM培养液中,B组和D组培养于含10%胎牛血清的MEM培养液中。即A组为PEG-IFNα+USP18-RNAi-LV 1#,B组为USP18-RNAi-LV 1#,C组为PEG-IFNa+NC-GFP-LV,D组为NC-GFP-LV,E组为空白组),在8h、3天、7天后三个时间点收集HepG2.2.15细胞的上清液检测HBVDNA的表达,并在感染后3天收集HepG2.2.15细胞的蛋白用westernblot检测ISG15蛋白的表达。结果：我们成功地构建了重组USP18 RNAi慢病毒(即USP18-RNAi-LV1#, USP18-RNAi-LV2#, USP18-RNAi-LV3#)。在重组USP18RNAi漫病毒转染HepG2.2.15细胞5天后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNAl,siRNA2,siRNA3组重组慢病毒与对照组(阴性组：NC-GFP-LV,空白组)相比均有不同程度地抑制USP18mRNA的表达,且成功筛选出最有效抑制USP18表达的重组慢病毒USP18-RNAi-LV 1#(P<0.05)。然后重组慢病毒USP18-RNAi-LV1#转染HepG2.2.15细胞后,随着时间的推移,对HBV复制抑制作用越来越显著,尤其A组。而western blot结果提示A组的ISG15蛋白表达增加,进一步证实了上述结果,在蛋白水平得到了进一步验证沉默USP18的表达能增强α干扰素抗病毒的活性,具有一定的临床意义。讨论：通过上述实验成功构建USP18 RNAi重组慢病毒,通过沉默USP18的表达增强干扰素的抗病毒作用,为慢性乙型肝炎患者的治疗带来新的希望。相信随着该领域研究的不断深入,应用RNA干扰技术沉默USP18的表达在抗HBV的基础研究必将走向临床应用。