背景与目的自1978年世界上第一例试管婴儿诞生以来,随着体外受精胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)技术的发展和不断成熟,IVF-ET的妊娠率及活产率均得到了很大提高。为了追求理想的妊娠率,国内不少生殖医学中心往往会采用增加胚胎移植数目的方法,导致多胎妊娠率大大提高,达到25～50%【1】,直接危害母婴的健康。美国生殖医学协会(the American society for reproductive medicine,ASRM)建议,对超排卵有足够反应的妇女一次移植胚胎数不超过2个,以减少多胎妊娠的发生率。因此,挑选出高发育潜能的胚胎、减少胚胎移植数目,成为了生殖医学工作者需要长期努力为之探索的重要命题。目前胚胎在植入前的质量评估手段主要包括形态学评分、代谢物分析、植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)。胚胎代谢产物测定尚处于实验阶段,PGD虽然临床上已经开展,但操作上对胚胎的创伤影响有待观察,并且其费用高、诊断耗时多等缺点,不易普遍开展。形态学评分具有经济、快速、无创等优点,因而是临床上最为常用的评估手段,可按细胞数目、碎片程度和卵裂球均匀性对早期胚胎进行评分,选择高分值的胚胎进行移植。细胞数目反映胚胎发育的速度,体现胚胎的活力。碎片数量及分布则将影响胚胎的种植潜能以及发育至囊胚的能力。但基于形态学参数的评估方法具有明显的局限性,不能有效避免遗传性疾病的传递,而且胚胎种植率只能达到40-50%左右,即移植到子宫内的胚胎绝大部分不能继续发育,因此有条件的中心还开展对PGD的研发,采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、聚合酶链反应(PCR)、比较基因组杂交(CGH)或基因芯片技术,对配子或植入前胚胎进行某些单基因疾病或染色体疾病的遗传学分析,选择健康的胚胎进行移植。PGD的难点在于细胞活检,细胞固定和单细胞遗传学诊断。PCR容易扩增失败、污染及等位基因脱扣而导致误诊。全基因组扩增及基因芯片技术价格昂贵、大都处于试验阶段。FISH具有安全快速、灵敏度高、技术成熟等特点,因此本实验采用5色探针同时进行FISH检测。染色体异常是胚胎发育潜能低下、种植率降低、新生儿出生缺陷和围产儿死亡的主要原因之一。植入前胚胎染色体异常多来自卵子减数分裂、特别是第一次减数分裂错误,少数来自于精子及其它因素的影响,多表现为数目异常(如非整信体、单倍体、多倍体、嵌合体等),少数为结构异常。从目前仅有的少数研究结果来看,形态学评估为优秀的胚胎,染色体异常率可以高达30%以上(32.3～44.4%)。鉴于胚胎形态与染色体异常之间的研究资料尚少,本研究拟采用FISH技术,分别对三种不同形态的胚胎,即高形态学评分胚胎、多核特征胚胎与空泡特征胚胎,进行单个卵裂球的染色体分析,为探索出更为高效准确的胚胎形态学评价体系提供实验依据。设计与方法1.标本的选择与分组(1)高形态学评分胚胎：收集广州军区广州总医院生殖医学中心2008年2月-2011年1月期间程序化慢速冷冻的第三天高形态学评分、经解冻复苏后卵裂球比例<50%且有核卵裂球≥2个的废弃胚胎52枚。同时按女性年龄划分为两组(≤35周岁组和>35周岁组)。(2)多核特征胚胎：选取2009年12月～2011年10月期间在广州军区广州总医院生殖医学中心实行IVF-ET的D2为多核(卵裂球核数目≥2个)的废弃胚胎30枚,将胚胎分成两组,A组为D2可见卵裂球内有多核特征(≥2个),D3却未观察到明显多核；B组为D2可见卵裂球内多核特征等于2个。(3)空泡特征胚胎：收集2009年12月～2011年10月期间在广州军区广州总医院生殖医学中心实行IVF-ET的具有空泡特征的废弃胚胎36枚。按D1空泡类型分为三组：A组为未见空泡组；B组为可见空泡<14μm组；C组为可见空泡≥14μm组。2.卵裂球FISH检测：提取出单个卵裂球,低渗固定、烤片,使用13、18、21、X和Y染色体探针进行FISH杂交,对荧光信号进行计数。3.统计分析：采用四格表X2检验进行两样本率的比较,当n≥40且所有T≥5时,采用一般卡方检验；当n≥40且有1<T<5时,采用连续校正卡方；R×C表x2检验进行多个样本率之间的比较,对于标本数n<40或1<T<5时采用Fisher确切概率法直接计算概率。统计软件为SPSS17.0。结果与讨论1.高形态学评分胚胎的染色体分析：在有荧光信号的113个细胞核中,发现染色体异常胚胎16枚,异常率为30.77%(16／52),异常类型包括13三体、18三体、21三体、性染色体单体与四体型。其中女性年龄≤35周岁的胚胎组,染色体异常率为26.47%(9／34),低于年龄>35周岁胚胎组的38.89%(7／18),但差异无统计学意义(p>0.05)。上述染色体异常比例低于同行学者的研究结果,说明我们目前实行的卵裂期D3胚胎形态学评价标准相对而言仍较为合理。2.多核特征胚胎的染色体分析：A组胚胎19枚,染色体数目异常胚胎14枚,异常率为73.68%;B组胚胎21枚,染色体数目异常胚胎15枚,异常率为71.43%。两组与高形态学评分胚胎的染色体异常率30.77%相比,均有显著差异(p<0.05)。上述结果说明只要在D2可见卵裂球内有多核特征的胚胎,无论D3发育为何种类型、是否观察到明显多核,其染色体异常率均显著增高,而且D2观察到的2核现象,很可能并非是处于有丝分裂期的正常现象,因此建议形态学评价指标中,加入多核这一重要的形态指标,并在临床胚胎移植时不建议选择此类胚胎。3.空泡特征胚胎的染色体分析：36枚胚胎中,染色体数目异常胚胎13枚,异常率为36.11%,与高形态学评分胚胎的染色体异常率30.77%相比,差异无统计学意义(p>0.05),说明空泡的出现并不意味着胚胎染色体异常率将显著上升。A组胚胎17枚,异常胚胎4枚,异常率为23.53%；B组胚胎13枚,异常胚胎5枚,异常率为38.46%；C组胚胎6枚,异常胚胎4枚,异常率为66.67%。三组间两两比较,染色体异常率差异无统计学意义(p>0.05),但三种空泡类型中,C组胚胎的染色体异常率有所增高。空泡是否影响妊娠率目前仍存在争议,对于A、B组空泡胚胎(通常一个卵裂球内可见空泡或者几个卵裂球内可见少量且很小的空泡),在其他形态学指标均优质的情况下,仍然可以考虑选择移植。而C组空泡胚胎(可见多个卵裂球内均有大空泡)的胚胎,则不建议选择移植。结论卵裂期胚胎形态学评估有其局限性,不能完全选择出染色体正常的胚胎,但是,合理的形态学评估指标,能有效的降低选择胚胎的染色体异常率。D2多核而D3未见多核、D2核数目等于2的多核胚胎,染色体异常率都较高,不宜选择作为移植用途。有空泡特征的胚胎,染色体异常率没有明显增高,对于A、B组空泡胚胎,仍然可以选择移植。形态学评价指标中,建议加入多核及空泡这两个重要指标。