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目的1.通过生物信息学的方法分析葡萄球菌中的CRISPR-Cas系统的结构特征,比较CRISPR阳性菌与CRISPR阴性菌之间耐药、毒力基因的携带情况。2.比较MRSA与MSSA菌株耐药、毒力基因的携带情况,分析SCCmec分型及不同型别携带耐药、毒力基因的差异。3.了解金葡菌MLST和spa分型,比较不同型别携带耐药、毒力基因的差异。方法1.从GenBank上下载基因组完成图的金葡菌序列,利用CRISPRs finder和CRISPRCas Finder进行CRISPR位点和cas基因的识别。根据cas基因的序列使用BLAST搜索同源序列。RNAfold web server对重复序列进行RNA二级结构的预测。CRISPR Target为间隔序列匹配前间隔序列,并查看其所在基因编码产物。使用MEGA-X为cas基因绘制进化树。2.在Center for Genomic Epidemiology中检测金葡菌的耐药、毒力基因,预测金葡菌的SCCmec、MLST和spa型别。3.使用SPSS 21.0进行统计分析,比较CRISPR阳性菌与CRISPR阴性菌、MRSA与MSSA菌株之间耐药、毒力基因阳性率的差异。结果1.获得335株葡萄球菌全基因组序列,52株携带68个确证CRISPR位点,其中15株携带CRISPR-Cas系统。纳入研究的27组CDRs中24组能形成保守的哑铃状RNA二级结构。130组间隔序列被用于匹配前间隔序列,其中61组匹配到了807个前间隔序列,大约70%的前间隔序列位于假设蛋白或未注释的基因上。识别到180组PAM,其中保守基序5’-ACGAGAA-3’广泛分布于crRNA5’端。cas1,cas2和cas基因簇系统发育树的整体拓扑结构没有差异。前导序列L1显示出明显的种内保守倾向,但金葡菌、假中间葡萄球菌和施氏葡萄球菌的L1一致。在前导序列L2中,除2株路邓葡萄球菌外,其余葡萄球菌基本一致。2.在325株金葡菌中共携带到6类26种耐药基因,阳性率最高的是mecA(64.31%),最低的是erm(C)、erm(T)、cat(pC194)、cat(pC233)和cfr,其阳性率均为0.31%。共携带3类32种毒力基因,阳性率最高的是hlgA和hlgB,其阳性率均为100%,阳性率最低的是eta(1.54%)。3.与CRISPR阴性菌株相比,阳性菌株中耐药基因blaZ、vga(A)V、fexA、tet(M)、tet(K)和tet(L)的阳性率高(P<0.05);CRISPR阳性菌株中毒力基因splE、splB、splA、ACME、scn、sak、lukF-PV、lukS-PV、lukD、lukE、seg、sen、seu、sei、sem、seo、sea/sep、sek、seq和hlgC的阳性率低(P<0.05)。4.在325株金葡菌中共有211株MRSA。与MSSA菌株相比,MRSA中耐药基因aadD、aac(6’)-aph(2’’)、ant(6)-Ia、ant(9)-Ia、aph(3’)-III、blaZ、mecA、erm(A)、vga(E)、tet(M)、tet(K)和dfrG的阳性率高(P<0.05);MRSA中毒力基因ACME、scn、sak、lukF-PV、lukS-PV、sek和seq的阳性率高(P<0.05),而splE、eta和tst的阳性率低(P<0.05)。在211株MRSA中共有16种SCCmec型别,在金葡菌中最常见的型别是Ⅳa型。SCCmecⅤ型菌株携带的耐药基因种类最多,但大多基因的阳性率偏低,SCCmecⅢ型菌株携带耐药基因数目最多,SCCmecⅣ型菌株携带毒力基因种类最多,但大多数毒素基因的阳性率偏低,SCCmecⅡ型菌株携带毒力基因数目最多。5.在325株金葡菌中,有318株可以进行MLST分型,共有58种ST型别,其中ST8型别的菌株所占比例最高。ST398型菌株携带的耐药基因种类最多,但大多基因的阳性率偏低,ST239型菌株携带耐药基因数目最多,ST8和ST5型菌株携带毒力基因种类最多,且大多数基因的阳性率偏高,ST5型菌株携带毒力基因数目最多。6.在325株金葡菌中,有317株可以进行spa分型,共有99种spa型别,其中t008型别的菌株所占比例最高。t034型菌株携带的耐药基因种类最多,t037型菌株携带耐药基因数目最多,t002型菌株携带毒力基因种类最多,且大多数基因的阳性率偏高,携带的毒力基因数目也最多。结论1.金葡菌中孤立的CRISPR阵列和CRISPR-Cas系统结构特征差别很大。CRISPR位点在金葡菌中的转移与SCCmec有关。2.与MSSA相比,MRSA中耐药、毒力基因的阳性率更高。3.在金葡菌中,不同MLST、spa型别的菌株携带的耐药、毒力基因差异大,但其中阳性率高的菌株大多属于MRSA。