运动和黄芪多糖联用对骨髓抑制大鼠造血微环境的影响

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研究目的:通过对骨髓抑制大鼠造模、运动训练及黄芪多糖干预,观察运动和黄芪多糖对骨髓抑制大鼠造血细胞增殖和动员作用,明确运动训练和黄芪多糖联用促进成骨分化抑制成脂分化,进而改善骨髓抑制大鼠造血微环境,并试图解释改善造血微环境的微观机理。  研究方法:6周龄雄性SD大鼠,随机筛选分为5组(每组9只):1组:对照组(Sedentary)、2组:骨髓抑制组(CTX)、3组:抑制+黄芪组(CTX+APS)、4组:抑制+运动组(CTX+Ex)、5组:抑制+黄芪+运动组(CTX+APS+Ex)。骨髓抑制造模方法:以30mg/kg/d剂量连续腹腔肌注环磷酰胺(Cy)6d。运动训练方案:从第一次注射Cy一小时后开始,在ZH-PT型跑台上运动,6d/W,周日休息。1W:10m/min,20min/d,2W:14m/min,30min/d,3W:17m/min,30min/d。第四、五、六周重复第一、二、三周。N、CTX、CA组放在跑台上在同一日用相同的方法干预但不进行运动。中药干预方案:造模成功后第二天起,以500mg/kg/d剂量连续灌胃黄芪多糖液5d。在末次训练结束24小时后用20%乌拉坦(5ml/kg)麻醉大鼠,腹主动脉取血入无菌真空抗凝采血管约1ml测其外周血细胞数目的变化检测外周血造血干细胞(CD90+CD45-)数量变化;再腹主动脉血入无菌真空非抗凝采血管约3ml,37℃水浴30min,3000r/min离心20min,EP管分装血清,-20℃冷冻保存,测其EPO、IL-3变化。取去除红细胞后的骨髓单个核细胞悬液,按1x104/孔接种于完全甲基纤维素培养基,进行红系造血祖细胞培养分别计数晚期红系祖细胞(CFU-E)和早期红系祖细胞(BFU-E),并拍照;调整大鼠骨髓单个核细胞浓度为1x106个细胞加入10ulFITC标记的大鼠抗大鼠CD45抗体,对照管加入等量 PBS,混匀后置于4℃避光反应30min。向待测液中加入红细胞裂解液1ml,充分混匀后避光反应5min,在离心机上以2000r/min离心5min后弃上清液,加入0.5mlPBS重悬,上流式细胞仪检测(CD90+CD45-)。取10%多聚甲醛固定大鼠股骨,脱钙,常规石蜡包埋切片,二甲苯脱蜡,LEICA骨切片机连续切片4-6张,厚度8微米,常规HE染色,统计脂肪细胞的含量百分比,并用SPSS17.0 for Windows进行相关统计检验。  研究结果:  1、外周血参数值检测结果显示,经Cy腹腔注射造模后,CTX组的WBC、RBC、PLT与Sed组比较,仍处于较低水平,差异具有显著性P<0.01,表明骨髓抑制动物模型造模成功;检测结果还显示CAE对红细胞数目的提升作用显著,其它细胞数目变化不明显。单纯的中药组CA比单纯的训练组CE对WBC、PLT促进作用明显,但并未达到显著性。  2、CFU-E:CTX与S比较P<0.01,说明模型组,经化疗后,不做任何处理,干细胞红系集落仍处于较低水平。CAE组与CTX、CE组比较P<0.01,说明运动和黄芪多糖联用对骨髓抑制大鼠红系集落形成单位集落产率有明显的刺激作用。在六周的实验周期里,单纯的中药组对BFU-E的提升作用显著,CTX、CA、CE组中BFU-E和CFU-E的量都明显低于正常组。  3、在大鼠干预六周后BM细胞与PB细胞中,与正常组S比较,CTX组CD90+CD45-细胞百分率呈明显减少趋势(P<0.01)。第6周,CA、CE、CAE组 BM细胞中CD90+CD45-细胞百分率明显高于 CTX组,CE、CAE组与单纯的中药组比较发现,有运动干预的CE、CAE组中CD90+CD45-细胞百分率明显的要高于单纯的中药组。第6周,CA、CE组PB细胞中CD90+CD45-细胞百分率明显高于CTX组,而CAE组的P<0.01,具有非常显著性差异。  4、CE、CAE血清EPO的量显著高于S组(CE组P<0.01、CAE组P<0.05)。CA、CE、CAE组大鼠血清EPO显著高于CTX(P<0.05)。CA、CE、CAE组大鼠血清IL-3明显高于S(P<0.05),CE、CAE组大鼠血清IL-3明显高于CTX组。  5、胫骨HE切片发现,与正常组比较CTX、CA、CE、CAE中骨髓脂肪含量都明显高于正常组 P<0.05,与抑制组比较 CA、CE、CAE中骨髓脂肪含量都显著低于抑制组(CA、CE组P<0.05,CAE组P<0.01),与单纯的运动组比较CAE组骨髓脂肪含量又明显低于运动组,P<0.05。  结论:  1、本研究从造血细胞存活、增殖、造血生长因子(EPO、IL-3)、骨组织形态学等方面对运动和黄芪多糖联用在造血调控方面的作用及机制进行了研究,证实对运动和黄芪多糖联用对Cy所致骨髓抑制具有一定缓解作用,比单纯的中药对骨髓抑制大鼠造血功能恢复作用效果更佳。  2、本研究结果显示运动和黄芪多糖联用对骨髓抑制大鼠造血调控可能是多途径、多层次的。一方面运动训练加速血细胞的新陈代谢,运动和黄芪多糖同时具有动员造血干细胞的增殖分化能力;另一方面运动训练通过刺激基质细胞和骨骼肌细胞分泌EPO、IL-3等多种细胞因子协调作用,此外,运动训练可以促进骨髓成骨细胞分化,减少脂肪细胞分化,改善造血微环境,进而促进造血恢复。
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