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研究背景:静脉血栓栓塞症（Venous thromboembolism,VTE）,是一种常见病和潜在的致命性疾病,其发病率随着年龄增加呈指数增长。目前VTE的治疗方法有抗凝治疗、溶栓治疗、手术取栓和机械血栓切除等。其中,抗凝治疗是基础,能有效防止血栓进展,但不能快速溶解血栓、恢复静脉通畅;手术取栓和机械血栓切除术虽可快速恢复血管再通,但同时易损伤静脉管壁和瓣膜功能,远期疗效较差。根据VTE抗血栓治疗指南的提示,患者最有可能从溶栓治疗中获益。溶栓治疗可分为经静脉系统溶栓（Systemic thrombolysis,ST）和导管接触性溶栓（Catheter-directed thrombolysis,CDT）,与ST相比,CDT能提高血栓的溶解率,减少溶栓药物使用剂量,缩短治疗时间,降低出血并发症的发生率,预防PTS发生。因此,在临床上得到了广泛的应用。超声溶栓（Sonothrombolysis）是一种相对较新的溶栓治疗方法,其溶栓机制主要以超声空化效应和机械效应为主,利用微泡空化谐振甚至“内爆”释放的冲击波、微射流和辐射力等机械能量使血栓表面或内部形成无数微小凹孔和孔隙（即声孔效应）,从而促进了药物渗透和血栓溶解。微泡（Microbubbles,MB）作为诱导产生空化效应的关键因素,具有降低发生空化效应的声压阈值和增强空化强度的作用。近年来,有学者对体外治疗性超声（External therapeutic ultrasound,ETUS）联合静脉输注微泡的溶栓方法进行了临床研究,但由于经静脉输注的微泡无法进入梗阻性血栓内部,加上体外超声辐照常缺乏合适的声窗,从而削弱了超声空化效应,因此,ETUS联合静脉输注微泡的治疗效果一直不理想。美国EKOS公司的EKOS?超声导管是一种介入血管腔内的新型溶栓治疗方法,即综合了CDT和超声溶栓的优点。该超声导管应用于临床治疗肺栓塞（Pulmonary embolism,PE）、急性脑梗死和静脉血栓形成等,已获得肯定的治疗效果。其优势在于经多侧孔鞘管给药,不仅使溶栓药物直接作用于血栓内部,而且同时给予管腔内超声辐照,可促进药物向血栓内渗透,从而增强了药物溶栓疗效。因此,本研究采用经EKOS?超声导管联合血栓内同时注射微泡和尿激酶（Urokinase,UK）的方法进行体外溶栓实验,以达到增强尿激酶的溶栓效果。在此基础上,本课题组又研制了一种超声参数可调并能输出稳定声压激励微泡空化的血管内超声溶栓导管,有望最大限度地发挥微泡介导的超声溶栓的优势,获得更为快速、有效的溶栓效果。研究目的:1.探讨EKOS?超声导管联合血栓内注射微泡增强尿激酶体外溶栓的治疗效果。2.研制一种超声参数可调并能输出稳定声压激励微泡空化的血管内超声溶栓导管,并验证其联合血栓内注射微泡增强尿激酶体外溶栓的疗效。材料与方法:1.主要实验仪器装置:（1）EkoSonic?超声溶栓导管系统:MACH4,由美国EKOS公司生产,配备多侧孔给药鞘管、多换能器超声发射轴芯和EkoSonic控制单元,其轴芯在治疗区有12个微型超声换能器,发射频率为2.2 MHz。（2）自制超声溶栓导管实验样机:深圳市索诺瑞科技有限公司生产,发射频率为2.8 MHz,声压档有0～11档,脉冲重复频率分别有50、100、200、300、500和1000 Hz,脉冲数量分别为15、30、50、80、100和300。（3）微量蠕动泵:BT-100E,重庆杰恒蠕动泵有限公司生产。（4）双通道微量输液泵:LD-P2020Ⅱ,上海蓝德医疗机械有限公司生产。（5）恒温水浴箱:德国HUBER公司生产。（6）针式水听器:HNC-0400,美国ONDA公司生产。（7）数字示波器:DSO9064A,美国Agilent公司生产。（8）荧光显微镜:BX3-CBH,日本OLYMPUS公司生产。（9）电子天平:UTP-313,上海花潮电器有限公司生产。（10）体外溶栓实验装置:由微量蠕动泵、双通道微量输液泵、恒温水浴箱、EKOS?血管内系统和自制模拟血液循环的管道组成。在管道的入口处安装三通管连接另一管道入口便于EKOS?超声导管的插入,血栓样品池两端连有一管道以模拟开放的侧支循环。置整个体外循环管道于37℃恒温水浴箱中。将含有10%牛新鲜冰冻血浆的磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline,PBS）作为循环液,蠕动泵以60 r/min的速度工作。2.主要实验试剂:（1）无菌抗凝新生牛血:500 ml,北京索莱宝科技有限公司生产,4℃储存。（2）牛血浆:500 ml,郑州九龙生物制品有限公司生产,-20℃储存。（3）注射用尿激酶:10 5 IU/瓶,丽珠集团丽珠制药厂生产。（4）注射用全氟丁烷微球:浓度为1.2×109/ml,英文名称:Sonazoid?,中文名称:示卓安,由挪威GE医疗公司生产。（5）注射用六氟化硫微泡:59 mg,英文名称:SonoVue?,中文名称:声诺维,由Bracco Suisse SA公司生产。（6）无水氯化钙:500 g,北京索莱宝科技有限公司生产。（7）PBS缓冲液:1000 ml,武汉博士德生物工程有限公司生产。（8）4%组织细胞固定液:500 ml,北京索莱宝科技有限公司生产。3.实验方法:实验一:EKOS?超声导管联合微泡增强尿激酶溶栓的体外实验（1）测量EKOS?超声导管声学参数:应用针式水听器,分别于换能器晶片下方距水听器1、2、3、4和5 mm处,对其峰值负压（Peak negative pressure,PNP）进行测量并记录。（2）制备血栓:取10.0 ml无菌圆底EP管,每支各加入8.0 ml无菌抗凝新生牛血和5%氯化钙溶液264μl（33μl/ml）,混匀后静置于37℃恒温水浴箱中。3 h后将其取出,去除血清,PBS液冲洗3次,滤纸吸干血栓表面液体后应用电子天平称量血栓的初始质量（W0）。（3）实验分组:将前期制备的90份同质血栓样本随机分为6组（n=15）,分别为:超声+微泡+尿激酶联合组（联合组）、超声+尿激酶组（US+UK组）、超声+微泡组（US+MB组）、超声组（US组）、尿激酶组（UK组）和对照组。（4）评价指标:（1）计算并比较各组血栓溶栓率。（2）观察各组残余血栓中红细胞和纤维蛋白的分布情况。实验二:自制血管内超声溶栓导管的声学检测及体外溶栓效果初步研究（1）检测自制超声溶栓导管声学参数:应用针式水听器,分别于换能器晶片下方距水听器2和3 mm处,对不同换能器、不同声压档、不同角度、无鞘管及套有鞘管时对应的峰值负压进行测量并记录。（2）制备血栓:制备方法同前。（3）实验分组:共设有以下3组,分别为:超声+微泡+尿激酶联合组（联合组）、超声+尿激酶组（US+UK组）和尿激酶组（UK组）。（4）评价指标:计算并比较各组血栓溶栓率。实验结果实验一（1）EKOS?超声导管声学测量:换能器输出峰值负压范围为0.4～6.4 MPa,呈大幅度动态变化,占空比为24.86%,其参数不可调。（2）溶栓实验:联合组溶栓率为（41.9±4.5）%,US+UK组为（42.0±3.3）%,US+MB组为（28.4±3.3）%,US组为（23.9±3.0）%,UK组为（27.8±3.1）%,对照组为（17.5±3.7）%。联合组溶栓率与US+UK组溶栓率接近,均显著高于其余各组,差异均有统计学意义（均P<0.05）;US+MB组溶栓率与UK组溶栓率比较,差异无统计学意义（P>0.05）,但均高于US组和对照组,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）光镜观察:联合组和US+UK组与EKOS?超声导管接触处的血栓崩解较明显,红细胞分布较其余各组更松散。实验二（1）自制超声溶栓导管声学测量:峰值负压随着声压档升高逐渐增大,随着与水听器距离增大而逐渐减小,套有鞘管时测得的峰值负压较无鞘管时对应的峰值负压有所减小,不同角度测得的峰值负压在0.58～1.00 MPa之间波动。（2）溶栓率:联合组为（38.9±1.8）%,显著高于US+UK组（31.4±1.4）%与UK组（22.3±1.2）%,差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论:1.EKOS?超声导管可明显增强尿激酶对体外牛血血栓的溶栓作用,但在此基础上加入微泡对溶栓率无明显提高。2.自制超声溶栓导管可达到增强尿激酶的体外溶栓效果,微泡的加入可进一步提高溶栓率。