论文部分内容阅读
背景：多项大规模流行病学研究发现,适量饮酒可以有效预防动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生,降低冠心病的(coronary heart disease, CHD)发病率和死亡率。近来研究发现,主要是酒类饮品中的乙醇成份介导了饮酒对心血管系统的保护作用。乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase, ALDH2)是酒精代谢途径中的关键酶,可以将乙醛转化为乙酸排出体外。近些年来,ALDH2新的生物学功能也逐渐被发现。我们课题组和国内外多项研究证实突变型ALDH2基因是急性冠脉综合征发病的独立危险因素。一些国内外研究初步探讨了ALDH2参与AS进程的机制,多涉及其对机体HDL-C、炎症因子及氧化应激水平的整体调控。我们前期研究发现,适量乙醇可通过激活ALDH2进而增加人主动脉内皮细胞eNOS的活性。eNOS来源的NO是重要的心血管保护因子,具有调节血流动力学、拮抗动脉粥样硬化形成及进展的作用。然而,乙醇是否可通过ALDH2这一机制发挥抗AS的作用还需要进一步研究。因此,我们提出以下假说：适量乙醇可通过增强ALDH2酶活性来影响动脉粥样硬化的形成,可为防治AS疾病提供新靶点。目的：建立ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型,探讨ALDH2是否参与乙醇拮抗动脉粥样硬化斑块形成的作用。方法：1.动物喂养与处理：6周龄ApoE基因敲除小鼠适应性喂养2周后进行高脂饮食喂养,构建动脉粥样硬化斑块模型,随机分为生理盐水组(NS组)、乙醇组(ETOH组)、乙醇+NC-siRNA组(ETOH+NC-siRNA组)、乙醇+ALDH2-siRNA组(ETOH+ALDH2-siRNA组)。乙醇按0.3g/kg腹腔内注射,生理盐水同比例注射,每天一次；通过小鼠尾静脉注射小分子干扰RNA慢病毒,乙醇+NC-siRNA组注射阴性对照病毒悬液,乙醇+ALDH2-siRNA组注射ALDH2-siRNA病毒悬液,继续高脂喂养16周。2.超声检查：行体表主动脉根部超声,测出主动脉根部斑块面积。3.一般检查：取材前,用电子秤测量小鼠体重,从左心室抽取血液留取血清检测小鼠胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。4.组织学染色：预处理16周后,麻醉小鼠,取小鼠主动脉并固定后,将胸腹主动脉剥去外膜,进行大体油红0染色；对主动脉根部进行冰冻切片后,行切片油红染色及HE染色。5.蛋白质印迹：提取组织蛋白后,用western blotting的方法对目的蛋白ALDH2进行检测,利用GADPH作为内参进行定量分析。6. ALDH2活性测定：用酶标板测定主动脉ALDH2活性。7.统计学方法：各组数据采用均数±标准差(Mean±S. E.)表示,运用SPSS13.0软件进行统计分析。各独立实验至少重复3次。多个组之间的比较采用单因素方差检验(one-way ANOVA),采用SNK检验进行多组均数两两之间的比较。变量间的相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。结果：1.成功构建ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型。2.一般检查结果：乙醇干预或加小分子干扰RNA慢病毒处理对小鼠体重没有明显影响(P＞0.05)；与NS组相比,ETOH组HDL-C明显升高(P＜0.05)；与ETOH组和ETOH+NC-siRNA组相比,ETOH+ALDH2-siRNA组HDL-C降低(P＜0.05)；乙醇干预或加小分子干扰RNA慢病毒处理对TC、TG及LDL-C水平无明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05)。3.体表超声显示：与NS组相比,ETOH组斑块明显减少；与ETOH组和ETOH+NC-siRNA组相比,ETOH+ALDH2-siRNA组斑块增多。差异有统计学意义(p＜0.01)。4.组织染色显示：大体油红0与主动脉根部切片油红0染色结果一致,与NS组相比,ETOH组主动脉粥样硬化斑块的形成减少；与ETOH组和ETOH+NC-siRNA组相比,ETOH+ALDH2-siRNA组斑块明显增多。差异有统计学意义(p＜0.01)。HE染色图片可清楚显示小鼠主动脉根部形成了明显的动脉粥样硬化斑块。5.ALDH2蛋白表达显示：与NS组相比,ETOH组ALDH2蛋白表达增加；与ETOH组和ETOH+NC-siRNA组相比,ETOH+ALDH2-siRNA组ALDH2蛋白表达减少。差异有统计学意义(p＜0.01)。6. ALDH2的活性检测显示：与NS组相比, ETOH组ALDH2活性明显增加；与ETOH组和ETOH+NC-siRNA组相比,ETOH+ALDH2-siRNA组ALDH2活性减低,差异有统计学意义(p＜0.01)。ALDH2活性与HDL-C浓度呈直线相关(r=0.675,P＜0.01)。结论：适量乙醇可以减少动脉粥样硬化斑块形成；乙醇可以上调ALDH2活性及表达；抑制ALDH2表达后,乙醇抗AS形成的保护作用明显减弱,提示乙醇抵抗AS形成主要是通过激活ALDH2介导的。背景：随着人们生活水平的提高,肥胖症的发病率近年来在逐年增加。大量临床流行病学资料结果显示,肥胖患者发生高血压、血脂异常、冠心病、糖尿病的危险性明显增加,并且肥胖还是心功能不全的独立危险因素。心肌重构是指胶原代谢失调使胶原纤维在心肌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中过量积聚,引起心肌纤维化,进而使心脏结构和功能发生改变。研究显示,肥胖可以导致心室重构,进而使心功能受损。过氧化物酶体增殖物激活型受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPAR)是核激素受体超家族的新成员,PPAR α是其中的亚型之一,研究发现,PPAR α活化后可以减轻压力负荷过重引起的左室肥厚和心肌纤维化。PPAR α的激动剂非诺贝特(fenofibrate)现在应用广泛,关于非诺贝特对高血压心肌重构的影响已有相关研究,而对肥胖心肌重构的影响报道较少。因此本实验旨在运用超声心动图技术评价心脏结构与功能,并结合组织学改变,来探讨非诺贝特对肥胖大鼠心肌重构的作用,从而为药物干预心肌重构提供新思路。目的：应用超声心动图结合组织学改变来探讨非诺贝特对肥胖大鼠心肌重构的作用。方法：1.动物喂养与处理：高脂饮食喂养建立20只肥胖大鼠模型,随机分为肥胖组(OB组,n=10)和非诺贝特组(F组,n=10),同周龄SD大鼠10只作为正常对照组(NC组)。F组以非诺贝特60mg·kg-1·d-1灌胃8周,其余组予以等量生理盐水灌胃。2.一般检查：实验期间,干预前后测量大鼠体质量并留取数据；干预前后于颈静脉窦抽血,留作血清学检查。实验末处死大鼠,迅速取出心脏,剥去右室左右心房、周围结缔组织后,用电子秤测量实际左室质量。3.超声心动图检查：实验前后,行超声心动图检查,用M型超声测量舒张末期左室后壁厚度、室间隔厚度及左室舒张、收缩末期内径,计算左室质量(LVM)、射血分数(EF)及左室短轴缩短率(FS)。测量E、A峰血流速度,计算E/A值。4.组织学染色：实验末处死大鼠,将大鼠心脏取出,于固定液固定后,对心脏进行石蜡切片,进行HE染色和Masson染色。5.统计学方法：各组数据采用均数±标准差(Mean±S.E.)表示,运用SPSS13.0软件进行统计分析。各独立实验至少重复3次。对于多个组之间的比较,使用ANOVA检验,两两比较采用SNK检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。结果：1.一般检查结果：用药前,OB组和F组体质量及超声测量的左室质量较NC组增加(P＜0.01)。用药后,F组与OB组相比,体质量和左室质量明显降低(P＜0.01),超声所测得的左室质量与实体标本测量值呈正相关(r=0.98,P＜0.01)。血清学检查显示：用药前,OB组和F组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇等较NC组增加(P＜0.01),用药后,F组与OB组相比,总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇及游离脂肪酸均降低(P＜0.01)。2.超声心动图结果：用药前,0B组和F组室壁厚度、室间隔厚度较NC组明显增加,E峰、E/A值明显减低,EF值明显减低,差异有统计学意义(P＜0.01)。用药后,F组与OB组相比,室壁厚度、室间隔厚度减低(P＜0.01),E峰、E/A值增加(P＜0.01),EF值增加(P＜0.05)。3.组织学检查结果：HE染色显示,与NC组相比,OB组心肌细胞排列紊乱,细胞内可见肌纤维断裂；F组较OB组明显好转,心肌细胞排列较规整,未见明显的肌纤维断裂。Masson染色显示胶原纤维呈蓝绿色,与NC组相比,OB组心肌间质胶原纤维明显增生,排列紊乱；F组较OB组心肌间质胶原纤维明显减少。结论：非诺贝特具有改善肥胖大鼠心肌重构的作用,超声心动图能较全面评价此作用。