血管支架用ZE21B镁合金外泌体活性涂层的生物功能化及机制

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目前,全世界每年有超过千万人死于心血管疾病(CVD)及其并发症,其中,动脉粥样硬化以及动脉狭窄是心血管疾病最主要致病因素。临床常用的治疗手段是进行支架植入,从而重塑血管并稳定血流。镁合金支架由于其本身的可降解性以及良好的生物相容性,成为未来血管支架的发展方向。支架表面内皮化被认为是预防晚期血栓和增生的有效策略,但现有镁合金支架产品存在表面内皮化延迟缺陷,因此如何加快镁合金表内皮化成为本领域的瓶颈问题和研究热点。在众多研究中,在可降解镁合金表面制备生物相容性较好的涂层是更便捷有效、且更贴近临床需求的方法。本研究将源自人血浆的外泌体,通过多巴胺涂层固定在氟化的Mg-Zn-YNd(ZE21B)表面,形成具有活性的外泌体缓释涂层。外泌体是一种包含母细胞的蛋白质、遗传物质以及脂质的纳米级细胞外囊泡。该囊泡可以通过在靶细胞内释放内容物,从而调节细胞的行为。目前,大量工作集中在使用外泌体进行抗癌、促进细胞增殖等方面的研究,而将外泌体作为涂层材料制备在心血管支架材料表面则是近年才逐步开展的。为了确认提取外泌体的形态,使用了纳米颗粒跟踪分析,生物透射电镜等方法进行表征;为了制定外泌体涂层的工艺参数,选取了不同的外泌体浓度和制备时间进行筛选;为了分析外泌体涂层的形态和耐蚀性,使用原子力显微镜,傅里叶表换红外光谱以及电化学等方式对ZE21B表面的外泌体涂层进行了表征,并总结了外泌体涂层的形成机制;为了分析外泌体涂层的生物相容性,在涂层表面培养了人脐静脉内皮细胞,平滑肌细胞以及巨噬细胞,并通过免疫荧光染色以及流式细胞仪的结果,评价了快速内皮化的作用;在具备快速内皮化功能的基础上,对外泌体涂层的降解周期,进入细胞后的分布,以及对降解产物对巨噬细胞的表型和人脐静脉内皮细胞增殖的作用进行了较为深入的机理性分析。本文的研究主要包括以下几点:(1)利用提取的外泌体,通过调控自组装时间、外泌体浓度等制备参数,优化血管支架材料表面的外泌体涂层的治疗效果。结果表明,浓度为25μg/m L的外泌体悬液,在多巴胺涂层表面经过12小时的自组装,能够获得性能较为优异的外泌体涂层。(2)对优化后的外泌体活性涂层的形成机制进行了分析。多巴胺涂层可将外泌体稳定的固定在材料表面,外泌体与多巴胺表面的正负电荷作用加强了这种连接。利用原子力显微镜对涂层表面三维形貌进行了分析,发现外泌体在表面呈球状分布;对外泌体在表面的分布进行荧光表征,证明外泌体在表面的分布较为均匀;使用水接触角测试发现外泌体涂层提升材料表面的亲水性;该活性涂层的平均厚度约为0.64μm;通过对固体表面电位的测试,发现外泌体与多巴胺涂层表面存在正负电荷的吸引。(3)外泌体活性涂层对快速内皮化有明显的促进作用。外泌体涂层表面的内皮细胞增殖、迁移以及因子(CD31,NO)表达等明显提升;收缩型平滑肌细胞的平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达提升,但是增殖不明显;将内皮细胞与平滑肌细胞在涂层的浸提液中进行共培养,发现内皮细胞增殖速率较快;巨噬细胞的活性氧(ROS)以及TNF-α表达均有明显降低,细胞增殖速率放缓;通过动物实验,发现新生血管组织可以均匀地附着在含外泌体涂层镁合金植入材料表面;(4)ZE21B镁合金表面外泌体涂层能够在5天至7天之内缓慢释放外泌体,外泌体通过内吞作用被细胞吸收,并分布在细胞核、溶酶体以及线粒体周围,参与细胞的分裂以及增殖等生理过程;(5)负载外泌体涂的镁合金基体降解会加速内皮化的进程。降解过程中,ZE21B合金解产物中的镁离子提升了环境中镁离子浓度,加快了内皮细胞表面黏着斑的出现;此外,镁离子降低巨噬细胞炎性因子的表达,提升巨噬细胞向M2型分化的趋势;细胞内部的镁离子浓度紧随环境而改变,对细胞的调节是可逆的过程,不会损害细胞的钙泵的功能。使用培养过巨噬细胞的浸提液培养内皮细胞,能够促进内皮细胞的增殖和CD31的表达。外泌体活性涂层能够促进ZE21B镁合金表面的快速内皮化过程;其制备过程利用了多巴胺的粘附性和正负电荷的作用;外泌体涂层提升了表面内皮化速度,负载涂层的可降解镁合金则以降解产物的形式加速了快速内皮化作用。
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