【摘 要】
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目的:通过体外实验探讨华蟾素（cinobufagin,CINO）对人结直肠癌5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）耐药的逆转作用,明确缺氧诱导因子/血管内皮生长因子（Hypoxia-inducible factor-lα/vascular endothelial growth factor,HIF-1α/VEGF）通路在逆转结肠癌5-FU耐药中的调控作用。方法:1.华蟾素对HCT1
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目的:通过体外实验探讨华蟾素（cinobufagin,CINO）对人结直肠癌5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）耐药的逆转作用,明确缺氧诱导因子/血管内皮生长因子（Hypoxia-inducible factor-lα/vascular endothelial growth factor,HIF-1α/VEGF）通路在逆转结肠癌5-FU耐药中的调控作用。方法:1.华蟾素对HCT15/5-FU细胞耐药性的影响:通过MTT法观察亲本细胞HCT15和耐药细胞HCT15/5-FU对5-FU的敏感性,计算对应的半数抑制浓度及耐药指数;使用MTT法检测CINO对HCT15/5-FU细胞耐药性的影响。2.华蟾素对HCT15/5-FU细胞功能的影响:使用不同剂量的CINO联合5-FU处理HCT15/5-FU细胞:通过克隆形成法检测CINO对细胞增殖能力的影响;使用流式细胞术评价CINO对细胞凋亡和细胞周期的影响;利用划痕实验法检测CINO对细胞平面迁移能力的影响;通过Transwell法观察CINO对细胞立体迁移和侵袭能力的影响;使用Western blotting和RT-q PCR法检测CINO对上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白以及m RNA表达水平的影响。3.华蟾素逆转HCT15/5-FU细胞耐药性的机制:使用Western blotting和RTq PCR法检测CINO对HIF-1α/VEGF通路相关蛋白以及m RNA表达水平的影响,探讨该通路是否在CINO逆转5-FU耐药中参与调控;为了进一步验证HIF-1α/VEGF通路在逆转结肠癌5-FU耐药机制中的调控作用,加入抑制剂LY294002,使用Western blotting法检测HIF-1α/VEGF通路相关蛋白表达水平的变化。结果:1.MTT结果显示,与HCT15细胞相比,HCT15/5-FU的耐药指数约为8.720;CINO作用后,能够明显提升HCT15/5-FU细胞对5-FU的敏感性,显著降低耐药指数,逆转倍数为3.226,表明CINO处理后,对HCT15/5-FU细胞的5-FU耐药性具有逆转作用。2.华蟾素对HCT15/5-FU细胞功能的影响:克隆形成实验结果表明,与对照组相比,CINO抑制结肠癌5-FU耐药细胞的增殖能力;流式细胞术结果发现,CINO处理后细胞总凋亡率明显增加以及细胞周期中S期比例升高,提示CINO促进细胞凋亡,并伴随S期细胞阻滞;划痕实验结果显示,CINO抑制结肠癌5-FU耐药细胞平面迁移能力;Transwell实验结果提示,CINO显著抑制耐药细胞立体迁移、侵袭能力;Western blotting和RT-q PCR实验表明CINO显著上调ECadherin蛋白和m RNA的表达,抑制N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白和m RNA的表达。3.华蟾素逆转HCT15/5-FU细胞耐药性的机制:Western blotting和RT-q PCR实验表明CINO与5-FU的联合使用显著下调HIF-1α、VEGF蛋白以及m RNA的表达;加入抑制剂LY294002后的Western blotting结果显示,CINO或LY294002单独作用时下调HIF-1α、VEGF的表达,CINO与LY294002的联合作用阻断HIF-1α、VEGF蛋白的表达,进一步验证了CINO是通过调控HIF-1α/VEGF信号通路逆转结肠癌5-FU耐药。结论:体外研究提示,CINO具有逆转结肠癌5-FU耐药的作用,其作用机制可能通过调控HIF-1α/VEGF通路抑制EMT、血管生成。
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