一、研究背景: 化疗是免疫性疾病和肿瘤治疗中的一种重要手段，因其疗效确切，故临床应用广泛。然而，由于化疗药物对靶细胞的选择性较差，对正常组织细胞存在着明显的细胞毒性作用，在杀灭病变细胞的同时对正常组织和细胞也有不同程度的损伤。近年来年轻女性患者因化疗而导致卵巢功能低下和不孕的报道日渐增多，成为卵巢功能早衰(prematureovarianfailure，POF)的一个重要原因。 目前铂类药物对卵巢的毒性不明确，顺铂(cisplatin，CDDP)是一种临床上常用的广谱抗癌药物，无论是单独用药还是联合用药，均显示出明显的抗癌作用，属细胞周期非特异性药物。但随着给药剂量的增加，CDDP对机体的毒副作用也随之增强，限制了其临床大剂量使用。其中最严重的是肾毒性，其次为耳毒性、肝脏毒性、胃肠道反应及骨髓抑制，而在生殖毒性方面研究较少，且机制尚不十分清楚。近年研究表明，细胞凋亡是化疗药物引起卵巢结构及功能破坏的重要机制。受化疗药物影响，卵泡内一些特定的信号被激活而促使细胞发生凋亡，其中大中卵泡尤其是生长卵泡中颗粒细胞的异常凋亡，可导致卵泡提前闭锁，因此抑制颗粒细胞的异常凋亡就有可能保护卵巢功能。 大量的研究资料证实生殖激素在控制卵泡功能方面具有非常重要的地位，但生殖激素及相关因素种类繁多，调节网络和控制机理十分复杂，目前确切的激素调控机制还需深入探讨。雌激素作为卵巢分泌的主要激素之一，具有重要的生理功能。传统的性激素治疗卵巢功能早衰主要是为了改善患者围绝经期症状，降低血清降低血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)水平，升高雌激素水平。目前的动物实验表明：雌激素可以抑制多种组织细胞的凋亡，如内皮细胞、外周血单核细胞、神经细胞、骨细胞、心肌细胞等，说明雌激素可以通过不同的机制对不同的细胞产生抗凋亡作用。那么，雌激素对化疗所致的卵巢颗粒细胞毒性是否有保护作用，进而对化疗导致的卵巢功能损伤是否可以起到减轻或保护作用?其可能的机制是什么?这些都有待于我们进一步深入的研究和探讨。 二、研究目的: 本实验通过体外原代培养人卵巢颗粒细胞，建立卵巢颗粒细胞培养体系为深入研究POF建立细胞平台；初步研究化疗药物CDDP对卵巢颗粒细胞的毒性以及凋亡的影响；以细胞凋亡为切入点，探讨雌激素对CDDP所致卵巢颗粒细胞毒性的保护作用及其可能的机制。 三、材料与方法: 1.颗粒细胞来源2007年4～9月间，从在南方医科大学第一附属医院生殖中心接受体外授精-胚胎移植(IVF-ET)的不孕患者废弃的卵泡液中分离取得颗粒细胞。患者年龄27～35岁，有排卵证据，基础状态生殖激素水平正常，均为输卵管因素或男方因素所致的不孕。 2.CDDP对卵巢颗粒细胞体外增殖的抑制实验实验分6组：正常组及分别加入不同浓度(0.5、1.0、2.5、5.0、10.0)mg·L-1的CDDP(山东鲁南制药厂生产，粉针剂，10mg/支，批号0411042)与卵巢颗粒细胞共培养的另5组。培养48小时后，采用噻唑蓝(3,[4,5-dimehylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)法分别检测各组的吸光度值，根据吸光度值计算抑制率，并求出CDDP对颗粒细胞的半数抑制浓度(50％inhibitingconcentration,IC50)，后续实验应用IC50为CDDP的实验浓度。 3.CDDP联用17β-雌二醇对颗粒细胞体外增殖的影响实验分5组：IC50的CDDP组、IC50的CDDP同时分别加用浓度为(1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-10)mol·L-1的17β-雌二醇另4组(17β-Estradio，17β-E2购自美国CaymanChemical公司，粉剂，纯度>98％)。培养48小时后，采用MTT法，检测各组的吸光度值，根据吸光度值计算抑制率。 4.Hochest33258染色并于荧光显微镜下观察颗粒细胞凋亡的形态学特征实验分3组：正常卵巢颗粒细胞组、IC50的CDDP卵巢颗粒细胞组、CDDP联用17p-E2卵巢颗粒细胞组。培养48小时后，弃培养液，经Hochest33258染色，荧光显微镜下观察凋亡卵巢颗粒细胞形态学特征。 5.流式细胞仪(flowcytometry，FCM)检测颗粒细胞的细胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表达实验分3组：正常组、IC50的CDDP组、CDDP联用17β-E2组。卵巢颗粒细胞培养48小时后，离心收集细胞，经固定后用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表达情况。 采用SPSS11.5统计软件包处理数据：所有数据用均数±标准差(x±s)表示，卵巢颗粒细胞抑制率、细胞周期、凋亡率及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表达率均采用One-WayANOVA分析。若方差齐，组间比较用Student-Neuman-Keuls；若方差不齐，组间比较采用TambanesT2，以P<0.05为具有显著性。 四、结果: 1.卵巢颗粒细胞24小时内贴壁，倒置显微镜下观察到细胞呈不规则形或星形生长，细胞与细胞之间有延长的丝状突起相互连接。细胞核大、圆，胞质富含颗粒及空泡。 2.CDDP抑制卵巢颗粒细胞生长，其抑制作用随药物浓度增加而更加明显。当CDDP浓度为0.5mg·L-1时，IR为(0.13±0.02)％；对卵巢颗粒细胞无明显抑制作用(P=0.114)，当CDDP浓度为1mg·L-1时，IR为(9.20±0.66)％，显示抑制卵巢颗粒细胞生长，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.025)；当CDDP浓度≥2.5mg·L-1时，IR为(20.98±0.86)％，明显抑制卵巢颗粒细胞生长，与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。求出IC50的CDDP浓度为4.9mg·L-1。 3.IC50的CDDP浓度同时联用不同浓度的17β-E2，实验结果示：随着雌激素浓度的增加，CDDP所致卵巢颗粒细胞的抑制率逐渐降低；低浓度(1×10-10m01·L-1’)的17β-E2对这种抑制无明显影响，与IC50的CDDP组比较差异无统计学意义(P=0.113)；≥1×10-8mol·L-1的17β-E2可明显降低CDDP对卵巢颗粒细胞的抑制率，与IC50的CDDP组比较有显著性差异(P<0.01)，因此将1×10-8mol·L-117β-E2作为雌激素的最低有效药物浓度。 4.在荧光显微镜下，正常卵巢颗粒细胞核呈均匀的蓝色荧光。出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的亮蓝色，甚至见亮蓝色碎片。 5.当给予IC50的CDDP后，卵巢颗粒细胞出现了明显的凋亡峰，而加入17β-E2后凋亡峰明显减低。与正常组比较，G0/G1期这一阶段，CDDP组卵巢颗粒细胞百分比显著高于正常组(P=0.000)；而S期和G2/M期这2个阶段的CDDP组卵巢颗粒细胞百分比均显著低于正常组(P=0.000)：CDDP联用17β-E2组与正常组比较，在G0/G1期、S期及G2/M期这3个阶段中，每一阶段的卵巢颗粒细胞百分比与正常组比较均无统计学差异(P>0.05)。细胞凋亡比较中，CDDP组卵巢颗粒细胞凋亡率为(6.96±0.78)％，与正常组比较显著增加(P=0.000)，而CDDP+17β-E2组卵巢颗粒细胞凋亡率为(1.49±0.29)％较CDDP组显著降低(P=0.000)，并接近于正常对照组(1.93±0.18)％水平(P=0.310)。 6.促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2蛋白的表达结果：CDDP组卵巢颗粒细胞bax蛋白表达(52.66±1.77)％，较正常组(30.72±1.00)％显著增加(P=0.000)，bcl-2蛋白表达(39.67±0.67)％，较正常组(62.10±1.21)％显著下降(P=0.000)。而CDDP联用17β-E2组bax蛋白表达为(29.80±0.91)％、bcl-2蛋白表达为(60.49±0.79)％，与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。 五、结论: 1.化疗药物CDDP抑制卵巢颗粒细胞体外增殖，且在一定浓度范围内有剂量依赖关系；雌激素可以减轻顺铂对卵巢颗粒细胞的抑制作用。 2.CDDP对卵巢颗粒细胞周期的影响，主要是G0/G1期阻滞，其与细胞损伤、存活及凋亡密切相关。 3.雌激素可降低CDDP对卵巢颗粒细胞G0/G1期的阻滞，从而使卵巢颗粒细胞凋亡率降低，这可能是雌激素降低化疗所致卵巢颗粒细胞凋亡的机制之一。 4.CDDP诱导卵巢颗粒细胞凋亡，其中促凋亡基因bax低表达和抑凋亡基因bcl-2过表达可能是其诱导凋亡的部分机制。 5.雌激素抑制了卵巢颗粒细胞促凋亡基因bax的表达，从而减少了凋亡，保护了卵巢颗粒细胞，延缓了卵泡的过早闭锁。