本研究拟分三部分：首先：分离纯化培养乳鼠窦房结细胞，用免疫细胞化学检测其Kir2.1蛋白表达；第二：体外诱导MSCs使其分化成心肌样细胞；第三：构建、筛选针对大鼠心肌样细胞KCNJ2 mRNA的siRNA系列，然后用基于脂质体的转染试剂RNAi-Mate将siRNA转染到心肌样细胞中，通过荧光定量RT-PCR和Western Blot检测大鼠心肌细胞KCNJ2基因表达的抑制情况，并应用膜片钳技术观察干扰KCNJ2基因后，大鼠心肌样细胞内向整流钾电流的变化。为应用RNA干扰技术得到来源于MSCs的具有较高自律性的心脏起搏细胞、在活体大鼠实现生物起搏开辟新思路。 本研究共分三部分论述： 第一章原代纯化培养乳鼠窦房结细胞的形态和Kir2.1蛋白表达 研究目:的建立一套可靠的乳鼠窦房结定位、细胞纯化培养与鉴定技术，研究乳鼠窦房结细胞中Kir2.1蛋白表达水平。 方法:在石蜡切片中用HE染色、嗜银染色、髓鞘染色和Mallory磷钨酸～苏木素染色法(PTAH)进行乳鼠窦房结定位和形态学观察，确定其解剖位置；取SD乳鼠的窦房结组织，采用差速贴壁技术和BrdU处理的纯化培养技术进行原代窦房结细胞培养，观察培养细胞的形态和搏动频率，免疫细胞化学检测其Kir2.1蛋白表达。 结论:综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色三种方法可以准确地定位SD乳鼠窦房结。差速贴壁和BrdU处理的纯化培养技术可提高原代培养的乳鼠窦房结细胞纯度。乳鼠窦房结细胞中Kir2.1蛋白表达阴性。 第二章大鼠骨髓MSCs体外纯化培养及5-氮胞苷诱导后KCNJ2基因表达 研究目的 1.建立MSCs的体外分离纯化培养方法，研究MSCs的生物学特征。 2.用5-aza体外诱导使其向心肌样细胞分化，增强KCNJ2基因和Kir2.1蛋白表达。 方法1.无菌条件下获取SD大鼠的骨髓，采用密度梯度离心和差速贴壁法进行分离培养和传代增殖。观察细胞形态变化，计算MSCs的贴壁率和绘制生长曲线。流式细胞仪技术检测CD29、CD44和CD45的表达，进行细胞成份鉴定。 2.5-氮胞苷体外诱导MSCs 24h，观察其形态结构变化，诱导后4周免疫细胞化学法检测α-actin、肌钙蛋白T(cTnT)和Kir2.1蛋白表达，用RT-PCR和Western Blol检测诱导后KCNJ2基因mRNA和Kir2.1蛋白的表达。 结论:1.密度梯度离心和差速贴壁法可得到较高纯度的MSCs； 2.在5-氮胞苷的诱导下，骨髓间充质干细胞有向心肌样细胞分化的趋势，其KCNJ2基因mRNA和Kir2.1蛋白表达增高。 第三章 siRNA干扰KCNJ2基因表达对骨髓MSCs来源的心肌样细胞Ik1电流的影响 目的:1.建立RNAi-Mate转染MSCs的体外转染方法；建立KCNJ2 mRNA的荧光定量RT-PCR方法；设计合成、筛选出有效的KCNJ2 siRNA干扰系列。 2.检测siRNA干扰对心肌样细胞IK1的影响。 方法: 1.设计合成3对大鼠MSCs KCNJ2基因siRNA干扰系列；用基于脂质体的转染试剂RNAAi-Mate将siRNA转染到心肌样细胞中，倒置荧光显微镜观察转染效果，流式细胞仪检测转染后MSCs的细胞周期变化和转染率；荧光定量RT-PCR和Westem Blot方法筛选出有效的siRNA系列。 2.Westem Blot方法检测siRNA干扰5-aza诱导后MSCs的Kir2.1蛋白的干扰效率；用膜片钳技术检测siRNA干扰对MSCs来源的心肌样细胞Ik1电流的影响。 本研究主要结论： 1.乳鼠窦房结细胞中Kir2.1蛋白表达阴性。 2.密度梯度离心和差速贴壁法可得到较高纯度的MSCs； 5.氮胞苷诱导MSCs分化为心肌样细胞，KCNJ2基因mRNA、Kir2.1蛋白表达增高，内向整流钾电流(IK1)强度增加。 3.RNAi-Mate能有效地将siRNA转染到MSCs来源的心肌样细胞中；筛选出siRNA bp(+129～+150)为有效的KCNJ2 siRNA干扰系列。 4.siRNA干扰KCNJ2基因明显抑制MSCs来源的心肌样细胞的KCNJ2基因mRNA、Kir2.1蛋白表达和内向整流钾电流(Ik1)强度。