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背景虫媒病毒(Arbovirus)是指通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物,使脊椎动物发病从而传播疾病的一类病毒。山东省位于中国东部沿海,三面环海,地处黄河下游。省内水系较为发达,湖泊集中分布在鲁中南山丘区与鲁西南平原之间,山东省属于暖温带季风性气候,降水集中,雨热同期。复杂的地质地理条件,为媒介昆虫的滋生繁殖提供了有利条件。山东省在历史上是乙脑高发区,近年来成人乙脑病例出现不断增加的趋势,对于大年龄组人群中乙脑的防控工作应引起重视。山东省关于虫媒病毒的研究较少,对于全省开展的虫媒背景信息的调查也有待完善,而山东省部分地区夏秋季节存在不明原因发热和脑炎病例,因此本研究在2016年和2017年夏季,在山东省的济宁市、临沂市、东营市、济南市、淄博市和烟台市进行了蚊虫标本的采集,并进行了病毒的分离及鉴定。目的开展山东省蚊虫及蚊传虫媒病毒的基线调查,为当地虫媒病毒疾病的预防和控制提供科学依据及数据支持。方法在2016年和2017年在山东省采集蚊虫标本,并使用细胞培养法分离病毒,阳性分离物使用分子生物学技术进行病毒鉴定,使用二代测序获得病毒基因组,新分离病毒用ClustalX2.0、MegAlign、Mega5.2和BioEdit等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列分析及系统进化分析,使用电镜等方法对病毒进行形态学研究。结果1、2016-2017年在山东省济南市、烟台市、东营市、淄博市、临沂市、济宁市共采集蚊虫标本4属5种,共48139只,三带喙库蚊为优势蚊种,占89.77%。济宁市采集的蚊虫数量最多,占总数的25.77%;东营市占总数的24.49%;临沂市占总数的17.05%;济南市、烟台市、淄博市分别占总数的5.77%、3.58%和0.49%。采集生境集中在猪圈,且多为吸饱血的蚊虫。2、对山东省2016-2017年采集的蚊虫标本中的274批进行研磨,利用细胞培养法共分离得到23株病毒,经鉴定,包括21株JEV,1株CppDNV,1株KDV。21株新分离JEV均为基因Ⅰ型。系统进化分析结果显示,与山东2013年分离的两株JEV亲缘关系最近。使用实时荧光RT-PCR方法对274批蚊虫标本检测JEV核酸,结果共有53批阳性,阳性率为19.34%(53/274),所有阳性结果均从三带喙库蚊中检出。对新分离CppDNV非结构蛋白NS1和NS2部分核苷酸序列分析显示,该株与我国其他省市分离株的核苷酸同源性在98.9%-99%,系统进化分析显示所有中国分离株均位于同一进化分支中。新分离KDV为分节段病毒,共分为12个节段,利用Illumina测序方法对其全序进行测定,和NCBI上两株KDV(JKT-7075株与QTM27331株)的同源性比较:与我国蜻蜓目分离株QTM27331核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为86%-99%和88%-99%。结论本研究在山东省采集到了4属5种蚊虫标本。蚊种构成说明三带喙库蚊为优势蚊种。从2种蚊虫标本中分离到了 JEV、KDV和CppDNV。在山东省多个地区、多个蚊种中都分离到JEV并检测到其核酸,提示山东省自然界蚊虫中存在着较高的JEV感染率。首次在山东省分离到KDV,二代测序技术在少见病毒的分析与鉴定中发挥了重要作用,提高了分子生物学分析的效率与准确度。