论文部分内容阅读
目的：优化设计抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)基因及其突变体K4-S4基因，利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增DS4基因及K4-S4基因，构建pGEX-4T-1-DS4及pGEX-4T-1-K4-S4表达重组体；并在大肠杆菌BL21中对DS4及K4-S4表达重组体进行融合表达及纯化。
方法：根据抗菌肽DS4及K4-S4的氨基酸序列，按照Codon Usage Database中大肠杆菌偏爱的密码子原则对DS4基因及K4-S4基因进行优化，利用DNA Star和Oligo 6.0分别设计合成了4个寡聚核苷酸片段，通过SOE PCR获得DS4基因及突变体K4-S4基因，定向克隆入载体PUC-18中，经酶切、测序鉴定成功得到目的基因后，重组至融合表达载体pGEX-4T-1中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中，筛选得到阳性克隆，经IPTG进行诱导表达，分别在不同的诱导温度(37℃、30℃)、诱导时间(2-5h)、诱导浓度(0.1mM、1.0mM)下进行表达条件的优化，进行15％SDS-PAGE电泳显示，可表达出GST融合目的蛋白；经谷胱甘肽亲和层析柱纯化得到特异性目的蛋白。
结果：
1.通过SOE PCR，得到DS4及其突变体K4-S4目的基因片段，大小为103bp；
2.构建了克隆重组体PUC-18-DS4及PUC-18-K4-S4，经酶切和测序鉴定，结果表明正确获得目的基因。
3.构建了表达重组体pGEX-4T-1-DS4及pGEX-4T-1-K4-S4，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中，经酶切和测序，结果表明DS4基因及K4-S4基因与表达载体连接方向正确，可以进行诱导表达。
4.两种表达菌经0.1mM IPTG 30℃诱导5h时后，全菌体及上清进行15％ SDS-PAGE电泳，结果显示有32KD的融合蛋白条带出现且以可溶性形式存在于上清中。
5.表达的融合蛋白经谷胱甘肽亲和层析柱纯化，进行15％ SDS-PAGE电泳，结果发现得到了特异性目的蛋白，透析后经紫外分光光度仪分析，获得了0.2mg/ml的融合目的蛋白。
结论：同时成功获得DS4及其突变体K4-S4目的基因片段；成功构建了表达重组体pGEX-4T-1-DS4及突变型表达重组体pGEX-4T-1-K4-S4；成功实现了其在大肠杆菌中的融合表达及纯化，为进一步研究抗菌肽DS4基因的功能和开发新的药物奠定了基础。