论文部分内容阅读
研究背景和目的:血小板在血栓与止血中发挥重要作用,在血液循环中不断监控血管损伤的异常信号,维持血管系统稳态。为此,血小板具备快速活化的特征,这种高效活化机制也可能导致不必要的血小板激活,引起病理性血栓形成。但是,至今,我们对于静息状态下,血小板如何处于非活化状态的认识甚少。研究血小板的负性调控机制对于阐明血栓形成机制及血栓性疾病的发生与发展过程,均具有重要的科学价值和临床意义。大量研究表明,蛋白二硫键异构酶家族（Protein disulfide isomerase,PDI）中的PDI、ERp57及ERp72对血小板整合素αⅡbβ3具有还原酶活性,在血栓形成过程中发挥正性调控作用,但是该家族是否有成员发挥负性调控血栓形成不清楚。通过筛选,我们发现该家族另一成员TMX1具有氧化酶活性。我们将研究TMX1对血小板的调控是否具有负性作用,并解析其作用机制。本课题旨在发现对血小板功能起负性调控作用的二硫键异构酶,探索和认识调控血小板活化的正性与负性氧化还原平衡网络,为血栓性疾病的治疗和预防提供潜在干预靶点。研究方法:1.构建重组TMX1野生型和失活型TMX1胞外片段,通过检测其对还原酶和氧化酶的底物催化效率,评价TMX1的氧化酶和还原酶的活性。2.应用Q-PCR、Western blotting检测TMX1在血小板等血细胞中的表达,并利用流式细胞术分析其在血小板膜表面的表达情况。3.应用TMX1蛋白以及特异性TMX1抗体,综合检测TMX1在血小板聚集和颗粒内容物释放以及铺展中的作用。4.构建TMX1 KO-first全身性基因敲除小鼠,并应用Cre-Loxp技术成功制备了条件性敲除小鼠,应用RT-PCR和Western blotting方法,鉴定小鼠是否构建成功。5.应用尾巴出血模型、FeCl3诱导肠系膜动脉血栓形成模型以及激光诱导提睾肌动脉血栓形成模型,检测TMX1重组蛋白和基因敲除小鼠的表型,研究TMX1调控止血与血栓形成的功能。6.应用表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）检测TMX1与αⅡbβ3相互作用的亲和力7.应用 iodo-TMT、3-（N-Maleimidylpropionyl）biocytin（MPB）巯基标记的方法,分别在蛋白和细胞水平,检测TMX1对整合素αⅡbβ3的氧化还原作用,并进一步结合质谱技术,确定TMX1所作用的αⅡbβ3的半胱氨酸位点。8.应用流式细胞术,检测TMX1调控活化血小板αⅡbβ3与fibrinogen γ chain的结合。9.综合应用还原酶活性实验、血小板聚集及巯基标记等研究方法,探究TMX1对正性PDI分子的调控作用,认识他们调控血小板功能的网络机制。实验结果:1.静息血小板和内皮细胞均表达TMX1,并随血小板的活化在血小板表面表达增加;2.重组TMX1胞外片段蛋白抑制血小板聚集和ATP释放以及血小板铺展,重组无酶活性TMX1突变蛋白促进血小板聚集和ATP释放,提示TMX1对血小板的负性调控作用;3.抗TMX1抗体B01P促进血小板聚集、ATP释放,说明TMX1的作用靶点在血小板膜表面;4.TMX1缺陷增强血小板聚集、颗粒内容物释放以及αⅡbβ3活化,添加外源性TMX1野生型胞外片段蛋白逆转这种增强作用,为TMX1对血小板的负性调控作用提供了遗传学依据;5.与对照小鼠相比,TMX1敲除小鼠尾巴出血时间显著缩短,说明TMX1抑制生理性止血功能;6.FeCl3诱导肠系膜动脉血栓形成模型和激光诱导提睾肌动脉血栓形成模型中,TMX1缺陷导致血小板积聚减少,说明TMX1对体内血小板血栓形成起负性调控作用;7.TMX1蛋白抑制活化的血小板与fibrinogen γ chain的结合;8.应用iodo-TMT标记游离巯基,发现TMX1完全氧化αⅡbβ3自由巯基形成二硫键。应用MPB标记血小板膜表面的巯基,发现TMX1缺陷血小板表面β3亚基的自由巯基的增加,说明TMX1通过氧化αⅡbβ3中β3亚基中的二硫键,维持αⅡbβ3的非活化形式,从而负性调控血小板的功能;9.应用巯基蛋白组学分析,发现TMX1催化αⅡbβ3中的3对二硫键形成,包括Cys508-Cys521,Cys523-Cys544,Cys608-Cys655;10.TMX1呈浓度依赖性抑制ERp57和ERp72的还原酶活性,拮抗他们对血小板的正性调控作用;研究结论:TMX1通过氧化血小板表面αⅡbβ3自由巯基形成二硫键,负性调控血小板活化和血小板血栓的形成,并且TMX1拮抗正性PDI分子对血小板的调控。TMX1是至今发现的第一个负性调控血小板活化的二硫键异构酶,揭示了 PDI家族调控血小板功能的平衡网络机制。研究背景及目的:血栓形成包括血小板活化和凝血系统激活两个关键环节,二者在止血与血栓形成过程中相辅相成。凝血系统活化最终效应是导致纤维蛋白网状结构形成,而形成固体血栓凝块。如果促凝和抗凝之间失衡,就会导致机体出血障碍或过度血栓形成。至今,我们对于凝血系统活化的调控机制非常有限,尤其是在没有血管损伤时,凝血系统如何维持其静息状态不清楚。越来越多的证据表明,蛋白二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）家族催化凝血因子的巯基-二硫键交换反应,调控凝血因子的酶活性,以及凝血因子与活化血小板的结合,提示该家族介导凝血途径的调控。我们及其他学者发现,PDI家族PDI、ERP57和ERp72正性调控体内血小板积聚和纤维蛋白沉积,揭示了血栓形成的氧化还原调控机制,但是以下关键科学问题仍然没有解决:PDI家族是否负性调控凝血系统活化?作为跨膜型PDI家族成员,TMX1已被我们证实具有负性调控血小板活化的功能,那么TMX1是否与其它PDI家族成员类似,双重调控血小板活化和凝血系统激活?针对这些存在的关键科学问题,本课题旨在研究TMX1在凝血途径中的作用及其调控机制。实验方法:1.应用激光诱导的提睾肌动脉损伤模型,评价TMX1的缺陷或重组蛋白对体内凝血系统活化的影响;2.应用凝血酶生成实验,检测TMX1在组织因子依赖的凝血酶、FXa生成以及活化血小板介导的凝血酶产生,以明确TMX1作用的凝血途径;3.应用流式细胞术检测活化血小板表面磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）暴露,以及凝血因子与活化血小板的结合中的作用;4.应用巯基标记,检测TMX1对凝血蛋白变构二硫键的氧化还原作用;5.应用流式细胞术,检测TMX1对磷脂翻转酶活性的调控作用;6.应用比浊法,检测TMX1对纤维蛋白多聚化的影响。实验结果:1.应用激光诱导的体内血栓模型,发现β3敲除小鼠血小板因缺乏αⅡbβ3不能在血管损伤部位积聚,但是重组TMX1蛋白仍然抑制纤维蛋白的生成,提示TMX1直接抑制体内凝血系统活化的作用;2.应用凝血酶生成实验,发现重组TMX1蛋白在体外抑制活化血小板介导的内源性凝血系统活化,而不抑制组织因子（Tissue factor,TF）依赖的外源性凝血系统活化和FXa生成,说明TMX1选择性抑制内源性凝血途径;并且,与野生型血小板相比,TMX1缺陷血小板活化介导的内源性凝血酶生成增强;3.应用流式细胞术检测,发现野生型TMX1胞外片段抑制活化血小板表面PS表达,特异性TMX1抗体及TMX1缺陷增强活化血小板表面PS表达,说明TMX1抑制活化血小板表面PS暴露;4.野生型TMX1胞外片段抑制凝血因子与活化血小板的结合,TMX1缺陷血小板活化后与凝血因子结合增强,说明TMX1抑制凝血因子与血小板的结合;5.TMX1缺陷血小板表面外翻酶活性增强,提示TMX1抑制外翻酶活性;6.TMX1抑制纤维蛋白多聚化,TMX1缺陷血浆纤维蛋白多聚化增强,提示TMX1抑制纤维蛋白原纤维的横向缔合;7.应用巯基标记的方法,发现TMX1蛋白氧化纤维蛋白原αchain的自由巯基,该效应可能是TMX1抑制纤维蛋白多聚化作用的机制之一。研究结论:TMX1对凝血系统发挥负性调控作用,其作用机制可能包括两个方面:一是TMX1抑制外翻酶活性,阻碍活化血小板表面PS的暴露,抑制活化血小板介导的内源性凝血途径的活化;二是TMX1直接氧化纤维蛋白原α chain形成二硫键,抑制纤维蛋白多聚化,干扰纤维蛋白纤维网络的形成。