三氯生(Triclosan,TCS)在20世纪60年代首次作为抗菌剂和防腐剂被用于个人护理产品中,在近20年里,已经被越来越广泛地使用于个人护理、家居和工业产品中,如肥皂、牙膏、除臭剂、化妆品、洗发水、餐具洗涤液、消毒剂和许多塑料及纺织品。TCS的广泛使用导致了人类的普遍暴露,以至于在人类的各类组织和体液中都能检测到它的存在,如脂肪、脐带血、外周血、尿液和乳汁等。TCS在化学结构上属于卤代酚,是一种非离子型的广谱抗菌剂。目前,已有一些文献报道了TCS对生殖内分泌系统的干扰作用,且已有充分实验证据表明TCS为环境内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)。EDCs被定义为对维持自身平衡、生殖、发育和行为的体内激素的合成、传输、键合、作用或清除有干扰作用的外源性物质,这些物质能够模拟、强化或抑制激素合成的作用,在某些情况下,可能引发组织或器官功能异常和肿瘤发生。EDCs可引起卵母细胞染色体畸变,受精卵不发育而导致妊娠失败;可影响受精卵的发育及孕卵着床,出现早早孕丢失;可导致胚胎发育不良而致流产;可干扰胚胎发育关键性基因的表达,导致胚胎发育及分化异常。本研究首先通过检测人群尿液中TCS暴露水平,来探讨TCS暴露与自然流产之间的关联性;接下来通过体内模型(孕鼠)和体外模型(小鼠胚胎干细胞和斑马鱼胚胎)相结合的方式进一步阐明了不同窗口期TCS暴露对胚胎发育的影响及相关机制,从而全面地阐明TCS对胚胎发育的影响和可能机制。第一部分女性三氯生非职业暴露与自然流产的相关性三氯生(TCS)的广泛使用导致了人类的普遍暴露。体外和动物实验已证明,TCS可以对生殖和发育产生不良影响。然而人群中TCS暴露是否与女性自然流产有关依然缺乏流行病学证据。本研究评估了女性非职业人群中尿液TCS暴露和自然流产之间的关联性。本研究采用病例对照的设计,研究TCS暴露与女性自然流产的相关性。采用本实验室已开发的基于超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术的方法分析中国普通人群113例不明原因的自然流产病例和339例对照人群尿液中TCS的浓度;用多元Logistic回归和趋势性检验分析TCS暴露与女性自然流产的相关性。结果发现,中国普通人群中女性有较为普遍的TCS暴露;随着TCS暴露水平的增加,发生自然流产的危险度增加(随着暴露水平的增加,校正后的相对危险度分别为[1.00,2.00(1.08-3.70),2.36(1.29-4.34);趋势性检验P值为0.003]。本部分结果首次提示TCS的暴露可增加发生自然流产的风险,为TCS生殖发育毒性评价提供了流行病学证据。第二部分孕中期三氯生暴露诱导小鼠自发性胚胎丢失体外和动物实验已证明,TCS可以对生殖和发育产生不良影响。第一部分的人群研究提示TCS的高暴露可增加发生自然流产的危险。环境化学物对胚胎产生毒性作用的窗口期主要包括卵母细胞发育期、胚胎植入前期、植入期及植入后期。环境化学物可能在以上任何一个时期发挥作用,也可能在多个时期同时发挥作用。为了证实第一部分的人群结果和进一步探讨TCS胚胎毒性效应的确切窗口期和毒性剂量,我们选择染毒时期为胚胎植入后GD5-15,染毒剂量为1,10,100mg/kg/d。同时为了证实小鼠的染毒剂量是否可以较好地模拟人群的暴露水平,采用第一部分的基于UPLC-MS/MS技术的方法检测了不同染毒剂量组小鼠尿液中的TCS暴露水平。研究结果表明,10和100 mg/kg/day染毒组小鼠胚胎均重低于对照组,差异有统计学意义,且随着染毒剂量的增加,胚胎均重显著性下降。10和100 mg/kg/day染毒组小鼠胚胎丢失率明显高于对照组,差异有统计学意义,且随着染毒剂量和染毒时间的增加,胚胎丢失率显著性上升,说明胚胎植入后为TCS暴露胚胎毒性的效应窗口期。10mg/kg/d组的尿液暴露水平可外推到我们第一部分研究人群的高暴露水平;100mg/kg/d组的尿液水平可外推到美国人群的高暴露水平。综上所述,本研究经口动物染毒模型可以很好地模拟人的暴露途径和内暴露剂量,一定程度上可以模拟人群TCS的实际暴露状况。从整体动物角度进一步证明了TCS暴露与自然流产的因果关联,同时为探讨TCS对胚胎发育毒性的窗口期和剂量提供了很好的动物模型和参考依据。接下来需继续进行深入的机制研究。第三部分三氯生对小鼠胚胎干细胞和斑马鱼胚胎的毒性作用及机制胚胎干细胞(ESC)和斑马鱼胚胎为检测环境化学物对早期胚胎发育的影响提供了有效的体外模型。体外和动物实验已证明,TCS由于其内分泌干扰作用对生殖和发育功能产生了潜在的危害。我们前期研究从人群和动物角度也已经证实TCS暴露可以影响植入后胚胎发育。然而,TCS对早期胚胎发育是否产生影响及其机制尚不清楚。在本研究中,将小鼠胚胎干细胞(m ESC)急性暴露于TCS 24h后,评价了TCS的一般细胞毒性及其对m ESC多能性的影响。同时,将斑马鱼胚胎从2hpf至24hpf一直暴露于TCS,并对它们的形态进行评估。结果表明,与对照组相比,TCS可以引起细胞形态改变和细胞凋亡增加。TCS染毒最高浓度组(50μM)显著性降低了m ESC碱性磷酸酶的染色和活性。在m RNA水平,染毒组Oct4和Nanog的表达水平显著性低于对照组,但是Sox2在组间没有差异;在蛋白水平,TCS染毒组的Oct4,Nanog和Sox2的蛋白水平呈显著性下降。由于mi R-134可靶作用于Oct4,Sox2和Nanog,我们进一步检测了m ESC中的mi R-134表达水平,发现TCS可引起mi R-134表达水平呈显著性增加。在斑马鱼染毒实验中,暴露10h后,染毒组与对照组相比,斑马鱼胚胎形态没有明显的改变,Sox2的表达水平没有改变,但Oct4和Nanog的m RNA表达水平显著性减低;在暴露24h后,与对照组的胚胎均处于体节晚期相比,300μg/L组的斑马鱼胚胎虽已都进入体节期,但均处在体节早期,表现为明显的发育迟缓,与对照组相比,染毒组的Oct4、Sox2和Nanog三种基因表达水平均显著性上调。综上所述,本研究首次阐明了TCS暴露对m ESC的毒性作用和可能的机制,表明TCS干扰了m ESC的多能性,其机制可能是通过引起上游mi R-134的表达升高进而抑制下游相关的转录因子Oct-4、Sox-2和Nanog的表达。同时,本研究也首次阐明了TCS暴露对早期斑马鱼胚胎发育的毒性影响,发现TCS暴露对斑马鱼胚胎的存活率没有显著的影响;但可以在早期发育阶段(24h),在最高剂量组(300μg/L)引起胚胎发育阻滞。