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背景子宫内膜异位症(以下简称内异症)是指具有生长功能的子宫内膜组织(间质和腺体)出现在在子宫腔被覆盖内膜及宫体肌层以外的其他部位的妇科常见疾病。内异症在育龄期妇女中的发病率约为15%,主要临床症状包括疼痛(痛经、性交痛和慢性盆腔痛等)和不孕。内异症的发生机制至今仍然不清,导致其无法根治。大多数关于子宫内膜异位症的研究都是基于Sampson的异位种植学说。根据这一理论,脱落的子宫内膜细胞可随经血逆流,经输卵管进入盆腔,种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜,并在该处生长。近年研究发现,逆流经血携带活性氧簇,过多的活性氧在局部导致氧化应激,使异位细胞黏附生长,有利于异位病灶的形成。线粒体是产生活性氧和能量的主要来源。线粒体在能量代谢、衰老和凋亡中起着重要作用。已有研究表明,线粒体DNA突变与子宫内膜异位症相关。然而,关于线粒体与子宫内膜异位症发病发展的进一步研究较少。线粒体中不仅有产生活性氧簇的氧化系统,也有线粒体超氧化物歧化酶为主的抗氧化系统,有文献报道在异位子宫内膜中线粒体超氧化物歧化酶表达最高,该抗氧化酶如何调节线粒体影响疾病的进一步发展研究较少。研究卵巢内异位囊肿的氧化应激及其抗氧化系统,为进一步研究内异症提供新思路。研究目的1.研究子宫内膜异位症与氧化应激的关系,检测异位组,在位组,非内异组间质细胞的活性氧,以及三组间质细胞的线粒体电镜下形态以及线粒体氧化呼吸功能。2.研究线粒体超氧化物歧化酶对子宫内膜异位症发病机制的影响,研究它的抗氧化及其他作用。材料与方法本研究共收集了 151例子宫内膜标本,其中78例为子宫内膜异位症患者的异位内膜(EC),38例是子宫内膜异位症患者的在位内膜(EU),35例为非内异患者的子宫内膜(CE)。原代培养3组子宫内膜间质细胞,用流式实验检测3组ROS的多少,用透射电镜观察3组线粒体的形态,用Seahorse实验检测3组线粒体氧化呼吸的代谢功能。分别用免疫组化,荧光定量PCR和Western blot检测线粒体超氧化物歧化酶SOD2在3组中的定位和表达。用小干扰RNA转染敲减异位子宫内膜间质细胞中SOD2的表达,将EC组分为si-Ctrl组(对照组)和si-SOD2(转染组),用Seahorse观察这2组线粒体氧化呼吸代谢功能的变化,用细胞运动性和增殖性实验评估SOD2下降对子宫内膜异位间质细胞迁移和增殖能力的影响,并利用流式细胞技术检测SOD2下降细胞膜电位和细胞凋亡的影响。结果1.EC 组的 ROS 比 EU 组高 90%(P<0.01),比 CE组高 97%(P<0.01)。3组的线粒体拷贝数无差异,线粒体DNA编码的氧化磷酸化相关的基因表达无差异。2.透射电镜结果表明,EC组的线粒体数量比EU和CE的要多。EC组的线粒体在细胞核周围区域密集分布,形态大小各异,大部分线粒体形态上属于I类线粒体,呈椭圆形,有完整的线粒体外膜和平行排列的嵴,还有一部分线粒体形态属于Ⅱ类线粒体,其特征是独特的嵴结构,嵴不再平行排列,是与线粒体外膜分离的圆形结构,类似于蜂窝状结构,还有少数的线粒体归到Ⅲ类线粒体,其在线粒体一侧有不对称肿胀的电子半透明区域,里面没有嵴。EU组和CE组的线粒体分散在细胞内,呈椭圆短棒状,没有明显聚集现象,且2组细胞的线粒体基本都是Ⅰ类线粒体。EC组的线粒体平均长度720.5 nm,长于EU组(P<0.01)和CE组(P<0.0001)。3.EC组耗氧率和糖酵解都比EU组和CE组高。EC组的基础耗氧率比EU组高95%(P<0.0001),比CE组高51%(P<0.01);EC组的ATP相关的耗氧率比EU组高79%(P<0.001);EC组的储备的耗氧率比EU组低77%(P<0.0001),比CE组低81%(P<0.001);EC组质子泄露相关的耗氧率和非线粒体相关的耗氧率都比EU组和CE组显著增高。EC组的糖酵解比EU组高14%(P<0.001),比CE组高132%(P<0.001);EC组的糖酵解能力比CE组高81%(P<0.0001)。EC组的基础耗氧率/糖酵解比值较其他两组下降(P<0.01)且3组都小于1。结果表明子宫内膜异位间质细胞有氧呼吸和糖酵解旺盛。4.线粒体超氧化物歧化酶SOD2主要分布在子宫内膜的上皮细胞和间质细胞的细胞质,尤其是间质细胞。荧光定量PCR表明EC组SOD2的表达最高,大于EU 组(P<0.01)和 CE 组(P<0.001)。PCR 也表明 EC 组的 SOD2/GPx1 比 EU组和CE组高(P<0.01,P<0.01)。Western blot表明EC组SOD2表达最高,大于 EU 组(P<0.05)和 CE 组(P<0.0001)。5.si-SOD2组的耗氧率包括(基础耗氧率,最大耗氧率,ATP相关耗氧率,储备的耗氧率)都比 si-Ctrl组低(P<0.0001,P<0.0001,P<0.0001,P<0.001)。si-SOD2组的糖酵解水平包括(基础耗氧率,最大耗氧率,储备的耗氧率)都比si-Ctrl组稍有下降。si-SOD2组的基础耗氧率/糖酵解比值比si-Ctrl组高(P<0.0001)。6.si-SOD2组的细胞迁移能力和增殖能力较si-Ctrl组相比下降(P<0.001,P<0.001)。si-SOD2组膜电位较si-Ctrl组显著下降(P<0.001)。结论子宫内膜异位症与氧化应激有关。异位子宫内膜间质细胞的线粒体数量和能量代谢都较其他两组高。线粒体抗氧化酶SOD2在异位内膜表达较高,与子宫内膜异位症疾病相关。