细菌活的非可培养状态(Viable but nonculturable state，VBNC)作为微生物学的一个全新概念，近二十多年来受到微生物界的广泛关注。但是国内对于进入VBNC状态细菌的生物学特性以及致病性的报道很少。本论文对副溶血弧菌VBNC状态的进入、复苏以及VBNC状态的副溶血弧菌生物学特性以及毒力因子的检测进行了研究，建立了快速高效的检测VBNC状态副溶血弧菌的EMA-LAMP方法。主要研究内容和结果如下：　　 1、论文首先以低温寡营养条件诱导副溶血弧菌菌株进入VBNC状态，分别使用吖啶橙染色荧光显微镜计数法(AODC)、死/活细胞检测试剂盒以及涂布平板法(PC)确定副溶血弧菌能否进入VBNC状态。研究发现，在低温(4℃)寡营养条件下，副溶血弧菌进入VBNC状态的时间为60d；过程中，副溶血弧菌的存活曲线发生了明显的变化，当实验菌株进入VBNC状态时，总菌数与刚接种时的相差不大，活菌数比总菌数低了三个数量级，并且保持在此水平，而可培养细菌数为零。　　 用荧光显微镜、扫描电镜以及透射电镜对副溶血弧菌的VBNC状态、正常状态以及复苏状态进行观察，发现进入VBNC状态的副溶血弧菌形态上发生了变化，即由原来的杆状、短杆状或弧状变为球状，细胞体积明显缩小，同时通过透射电镜发现，VBNC状态的副溶血弧菌细胞质密度明显降低，细胞壁变厚。复苏后副溶血弧菌无论是在形态上还是在体积上与正常状态细胞几乎没有差异。　　 2、对VBNC状态、正常状态以及复苏状态的副溶血弧菌的其他生物学特性进行了研究，包括细胞壁抗性、细胞壁组成成分、核酸以及蛋白质的变化。研究结果表明，VBNC状态的副溶血弧菌与对数生长期、稳定期、死亡状态的细胞相比，细胞壁抗性明显增强，细胞壁中肽聚糖交联度明显增加。全菌蛋白SDS非连续变性电泳显示诱导30d的副溶血弧菌蛋白条带明显比正常状态的少，但是诱导60d即已经进入VBNC状态的副溶血弧菌的蛋白条带比诱导30d的蛋白条带多，而比正常状态的蛋白条带少。　　 3、采用添加酵母液、吐温80并升温的方法对VBNC状态的副溶血弧菌进行复苏，研究发现该方法可使VBNC状态的副溶血弧菌在24h内复苏为可培养状态。将VBNC状态以及复苏后的副溶血弧菌注射金鱼进行毒力测定，结果表明注射VBNC状态副溶血弧菌细胞的金鱼在实验期间未出现致病或死亡，而注射复苏后副溶血弧菌细胞的金鱼在5d后全部死亡。结果显示，VBNC状态的副溶血弧菌保持了其致病潜能，伴随着复苏的实现，其致病性得以恢复。同时使用LAMP方法对复苏后的副溶血弧菌进行扩增，检测到副溶血弧菌溶血毒素tlh基因。　　 4、对正常状态、复苏的副溶血弧菌细胞以API20E进行生理生化检测发现，复苏后的副溶血弧菌除了增加利用尿素的能力外，其余与正常状态的副溶血弧菌代谢能力相同，推测经历VBNC状态的副溶血弧菌复苏后基本恢复了正常的代谢过程。　　 5、本论文使用EMA(Ethidium monozaide)与LAMP(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法相结合，建立了快速检测VBNC状态副溶血弧菌的EMA-LAMP方法。通过实验优化了LAMP反应条件，并确定了EMA的最佳工作浓度为40μg/mL，该方法的检测灵敏度为12CFU/mL。通过对人工污染的模拟样品进行检测，发现食品基质不会影响EMA-LAMP检测灵敏度，为检测VBNC状态的细菌建立了一种快速灵敏的新方法。同时本论文对EMA-LAMP技术检测的灵敏度、特异性以及方法的稳定性进行了探讨，为试剂盒的开发提供了研究基础。