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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）,属于蜡样芽胞杆菌族,芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌,且伴随有伴胞晶体的产生。这种伴胞晶体对多种目标昆虫具有特异性的杀虫活性,是目前世界上农业生物防治中应用广泛的微生物杀虫剂。但是Bt制剂在田间应用过程中面临着持效期短的问题,主要由于遭受外界环境尤其是太阳强紫外照射导致Bt制剂中的晶体蛋白在作物叶面上易降解,缺乏稳定性,这也是目前制约Bt制剂向前发展的主要因素,亟待解决。功能基因组的研究为微生物学的发展提供了坚实的基础,模式菌株Bt HD73的基因组由本实验室于2013年完成测序,为开展以下生物信息学的工作提供了思路。研究发现σK因子的缺失能够阻止母细胞裂解,能正常产生伴胞晶体蛋白,且不产芽胞。在这种遗传背景下细胞壁能够有效保护伴胞晶体蛋白阻止紫外降解,且不影响对目标昆虫的活性,但是σK因子缺失会影响一些cry基因在芽胞晚期的转录活性以及生物总量。因此,十分必要发展一种可替代的方法能够阻止母细胞的裂解,但不影响芽胞和晶体的产量。肽聚糖水解酶又被称为自溶素,在芽胞杆菌属的母细胞裂解中起着非常关键的作用。研究表明在枯草芽胞杆菌中有三个水解酶参与母细胞的裂解,分别为CwlB, CwlC与CwlH。 cwlB、cwlC以及cwlH基因的单个缺失并不影响母细胞的裂解,说明阻止母细胞的裂解需要多个基因的同时缺失。本论文对Bt母细胞裂解的机制和参与这一细胞过程的水解酶功能进行了研究,主要内容如下：对枯草芽胞杆菌中参与母细胞裂解的三个水解酶基因进行生物信息学分析发现,CwlB、 CwlC以及CwlH均属于N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶,且结构域都包含有细胞壁的绑定结构域,在此基础上,依据Bt HD73的基因组序列以及RNAseq测序分析确定与枯草芽胞杆菌中三个水解酶与枯草芽胞杆菌中三个水解酶结构域最为相似的,被注释为芽胞期水解酶,编号为HD732493与HD732494,将该基因命名为cwlA与cwlB。RT-PCR结果表明cwlA与cwlB共转录,并形成一个单独的转录单元。5’-Race-PCR结果确定了一个转录起始位点位于cwlA起始密码子上游的第25个碱基“T”。β-半乳糖苷酶体外活性分析表明cwlAB操纵子受σK因子控制。PcwIA启动子在晚期调控蛋白GerE的突变体中,转录活性降低；凝胶阻滞实验结果表明PcwIA启动子与GerE蛋白体外不结合,说明cwlAB操纵子间接受GerE调控。利用同源重组的方法,构建了cwlAB操纵子两个基因的单突变体以及双突变体,并构建了相应的恢复菌株。光学显微镜观察结果显示与野生型Bt HD73的细胞形态相比,在T20时期,单突变体HD（△cwlA）芽胞和晶体全部被释放,与野生型保持一致；而单突变体HD（△cwlB）与双突变体HD（AcwlA△cwlB）一直到T24时期母细胞才裂解,芽胞和晶体被释放,说明cwlB参与母细胞的裂解,延迟了芽胞和晶体释放时间,而cwlA与母细胞裂解无关。芽胞形成率结果表明,与野生型Bt HD73相比,HD（AcwlB）略有降低；蛋白定量分析表明,cwlB的缺失并不影响晶体蛋白的产量。cwlB恢复菌株的细胞观察结果显示与野生型保持一致,说明芽胞和晶体的延迟释放是因为cwlB的缺失造成的。为了检测CwlB与细胞壁的绑定能力,CwlB-His的蛋白被纯化。WesternBlot检测结果显示cwlB能与细胞壁特异性的绑定进行水解作用。进一步分析CwlB的肽聚糖水解位点,将CwlB水解的肽聚糖的氨基酸残基用1-弗-2,4-二硝基甲苯标记,高效反向液相色谱（RP-HPLC）分析表明,CwlB是一个N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶；构建GFP与CwlB融合表达载体,激光共聚焦显微镜观察显示CwlB定位于细胞的表层。在Bt中cwlB的缺失能够延迟芽胞和晶体的释放时间,但是在乃4时期,母细胞依然能够全部裂解,这就意味着还存在其他的水解酶基因参与母细胞的裂解。依据Bt HD73的基因组序列以及RNAseq的数据信息,分析结果显示有三个水解酶基因是受σK因子控制,芽胞晚期开始表达,三个基因分别为HD733410、HD733157与HD733966。通过同源重组的方法分别获得三个基因的单突变体以及与cwlB组合的双突变体,光学显微镜观察结果显示三个基因的单个缺失以及与cwlB的双突变体均未阻止母细胞的裂解。同源序列比对结果显示HD73-3157与HD73-3966在蜡样芽胞杆菌族中是保守的,且与枯草芽胞杆菌以及蜡样芽胞杆菌族中已报道的已知功能水解酶基因的同源性非常低,可初步认定这两个基因为新型的水解酶基因,功能有待进一步验证。同时应用单交换原理快速检测细胞的形态筛选候选基因。检测结果发现在Bt HD73的HD73-5344属于肽链内切酶基因,β-半乳糖苷酶体外活性分析表明在HD73-5344芽胞期开始转录。通过同源重组的方法获得了单突变体以及与cwlB组合的双突变体。光学显微镜观察结果显示,与野生型Bt HD73相比,HD73-5344的缺失延迟了母细胞的裂解,但双突变体不仅阻止了母细胞的裂解,但同时也影响了芽胞和晶体的形成。芽胞形成率与蛋白定量分析表明,HD73-5344单突变体降低芽胞形成率,但不影响晶体蛋白的产量,而双突变体的活芽胞与晶体蛋白都未被检测到。具体的裂解机制还需更深一步的探索研究。