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背景:伴皮质下梗死及白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉血管病变(CADASIL)是由Notch3基因突变引起的遗传性血管性痴呆疾病。CADASIL的典型病理特点是血管壁中血管平滑肌细胞显著的进行性退化直至消失,并伴有Notch3胞外区及致密颗粒性嗜锇物质(GOM)堆积。遗传连锁分析已证实位于第19号染色体上的Notch3基因的突变是导致该病的原因,目前认为这是一种功能获得性突变,但是基因突变导致其具体获得何种新的功能及其相关机制目前尚不清楚。本实验就其可能获得的新功能和相关机制在多种细胞系中进行筛选和探讨。 方法:本实验在人胸主动脉平滑肌细胞(HAVSMC)、人肺成纤维细胞(IMR-90)、鼠小胶质细胞(BV2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7和HCC1937)上进行相关研究。首先我们用重组PCR的方法构建Notch3的CADASIL突变体R90C和R169C的真核表达载体,然后用脂质体(Lipofectamine2000)转染的方法将野生型(WT) Notch3及突变体R90C和R169C转染到以上细胞中。用蛋白免疫印迹(Western blot)方法研究胞外基质蛋白collagen和fibronectin及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达情况;用RT-PCR的方法检测炎症因子TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平的变化情况,用Griess法检测NO水平的变化情况;分别用划线法和细胞计数法检测肿瘤细胞迁移和增殖情况。所有数据分析采用统计学分析,P<0.05具有统计学意义。 结果:首先,用重组PCR的方法,我们成功构建Notch3的CADASIL突变体R90C和R169C的真核表达载体;然后将突变体转染到HAVSMC细胞中,发现胞外基质蛋白collagen和fibronectin的表达有明显上升,这与CADASIL的病理特征是相符合的,但在IMR-90细胞中胞外基质蛋白collagen和fibronectin的表达有明显下降;在BV2细胞中,我们发现突变体可以降低炎症因子NO水平,但对TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平没有影响;在HeLa细胞中我们发现细胞的迁移和增殖都有明显的上升,但在MCF-7和HCC1937细胞中却得出了与HeLa细胞相反的结果;在HeLa和IMR-90细胞中,突变体可以抑制DNMT1的表达,而野生型Notch3却无此调控作用。 结论:1、CADASIL突变体和野生型Notch3对细胞外基质蛋白collagen和fibronectin的表达,在HAVSMC和IMR-90细胞中有不同的调控作用;2、CADASIL突变体和野生型Notch3均可影响BV2细胞NO的释放水平;3、CADASIL突变体和野生型Notch3对肿瘤细胞迁移和增殖有不同的调控作用,且这种差异调控与肿瘤细胞种类有关。4、CADASIL突变体可以抑制HeLa和IMR-90细胞DNMT1的表达,而野生型Notch3却无此调控作用。 总的来说,我们发现Notch3突变体在不同的细胞系中呈现出不同的调控作用,提示Notch3突变体可能具有较多的生物学功能。我们的实验结果给进一步探索CADASIL发病机制和Notch3突变的潜在新功能提供了线索和新的启示。