目的采用“网络药理学-药效学-组学”整合研究策略,探讨红花三味散对酒精性肝损伤小鼠的保护作用及潜在的作用机制。方法1.通过TCMSP数据库检索收集红花三味散的化学成分,并经口服生物利用度(OB)和类药性(DL)筛选活性成分,依据反向药效团匹配方法和药物相似性方法预测化合物潜在靶点,进而构建化合物-靶点网络图;通过OMIM数据库和Dis Ge NET数据库收集ALD疾病相关靶点,并将化合物靶点与疾病靶点进行比对进而得到红花三味散治疗ALD的关注靶点;最后使用DAVID在线工具对关注靶点进行基因功能和信号通路分析。2.将ICR小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组(177mg/kg)和红花三味散低、中、高剂量组(0.65g/kg、1.3g/kg、1.95g/kg),每组15只。除空白组外,其余各组均用50°二锅头灌胃4周,建立小鼠酒精性肝损伤模型,除空白组、模型组给予蒸馏水外,各给药组分别给予相应药物干预。末次给药后检测各组小鼠血清AST、ALT、ALP、BILD、TBIL、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平及肝组织中SOD、MDA、GSH、IL-6、IL-1βIL-1、TNF-α的含量;免疫组化方法检测caspase-3、bax、bcl和cyp2e1蛋白水平;HE染色观察肝细胞病理改变。3.蛋白质组学分析:采用TMT(Tandem Mass Tags,TMT)定量蛋白质组学分析了红花三味散干预酒精性肝损伤小鼠肝脏组织蛋白表达谱,并进行蛋白质定量分析,最后对筛选出来的差异蛋白进行GO、KEGG功能富集分析和互作网络分析等一系列的差异蛋白功能分析。4.代谢组学分析:采用UHPLC-MS/MS技术分析红花三味散干预ALD小鼠的尿液样本,获取代谢物轮廓,并采用,并结合主成分分析(PCA)和正交校正的偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等方法挖掘红花三味散治疗ALD的特异性标志物,并其进行差异代谢物的通路富集分析。5.肠道菌群分析:基于Illumina Nova测序方法对细菌16S r RNA的V3-V4高变区进行测序,根据物种注释情况,进一步计算α多样性与β多样性,以及进行组间差异的比较,揭示红花三味散对对ALD小鼠肠道菌群结构及功能的调节作用。结果1.网络分析结果显示,从红花三味散中筛选得到的47个活性化合物直接或间接作用于64个ALD疾病的关键靶点,共涉及17个生物学过程及32条KEGG通路(P<0.05,FDR<0.05),说明红花三味散主要通过对化学Chemical carcinogenesis、细胞色素P450对外源物质代谢、Drug metabolism-cytochrome P450、TNF信号通路、PPAR信号通路、细胞因子与炎症反应等信号通路的干预来发挥治疗ALD的作用。2.小鼠酒精性肝损伤模型复制成功,与模型组相比,红花三味散能降低小鼠血清AST、ALT、ALP、TC、TG和LDL-C的含量,增加HDL-C含量;能够增加肝脏组织SOD和GHS的含量,降低MDA、TNF-α和IL-6的含量;能够降低小鼠肝细胞CYP2E1、caspase-3、Bax蛋白的表达;增加Bcl-2蛋白的表达;肝组织点状坏死、炎细胞浸润等病理症状明显改善。3.蛋白质组学结果中发现,与模型组相比,红花三味散组共筛选出84个差异蛋白,包括44个下调的蛋白和40个上调的蛋白;GO富集分析表明,这些差异表达蛋白主要参与各种代谢过程、氧化还原过程和细胞蛋白修饰等过程;主要分布在细胞质、细胞核、胞外区部分、内质网及线粒体等。KEGG富集分析表明,红花三味散主要调控代谢通路、化学致癌通路、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、Drug metabolism-cytochrome P450、谷胱甘肽代谢及Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450等信号通路。并通过免疫组化实验,确证了红花三味散对潜在关键靶标CYP2E1的下调作用。提示红花三味散可能通过降低CYP2E1的蛋白表达,从而降低炎症反而发挥保肝作用。4.代谢组学实验结果显示:在正离子模式和负离子模式中,正常组和模型组及模型组和红花三味散组小鼠代谢轮廓均完全分离,且负离子模式中红花三味散组和正常组代谢物有重合部分,说明酒精能使小鼠体内代谢紊乱,而红花三味散对ALD具有治疗作用。根据VIP>1.0,差异倍数FC>1.5或FC<0.667且P value<0.05筛选出了红花三味散治疗ALD的潜在生物标志物239个。差异代谢物的代谢通路注释和富集分析结果表明,红花三味散组主要对Steroid hormone biosynthesis、Drug metabolism-cytochrome P450、Metabolic pathways、Bile secretion及Inflammatory mediator regulation of TRP channels等代谢通路的调节而实现治疗ALD。5.16Sr RNA测序结果显示:Beta Diversity分析显示红花三味散可以改善酒精所致的菌群差异,进一步的研究表明,在门水平上,红花三味散提高了拟杆菌门Bacteroides)和厚壁菌(Firmicutes)细菌丰度,下调了变形菌门(Proteobacteria)含量,促进肠道共生菌的生长。在属水平上,Bacteroides、streptococcus、helicobacter、unidentified-Enterobacteriaceae和Odoribacter明显增高;unidentified-Lachnospiraceae、Alloprevotella和Lactobaculum明显降低了。结论红花三味散对小鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用。其机制可能与降低机小鼠血清中ALT、AST等酶类的活性、减轻炎症因子的释放、调控肝细胞凋亡、抑制CYP2E1异常活化、改善脂质代谢、调节代谢紊乱及肠道菌群的结构而发挥治疗作用。通过网络药理学初步预测了红花三味散的物质基础和核心靶点,为深入阐述红花三味散治疗ALD的作用机制提供了科学依据。