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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪和野猪的烈性传染病,严重影响着养猪业的健康发展。我国采用强制疫苗免疫和病猪扑杀相结合的方式净化CSF,但近年来隐性感染和慢性持续性感染给CSF的防控带来了新的挑战。全面了解CSFV的增殖和致病机制有助于CSF的净化。多年来,学者对CSFV入侵、基因组复制以及免疫机制开展了研究,但对于CSFV子代病毒颗粒的组装、胞内转运和细胞间传播等过程知之甚少。因此,本文研究了外被体蛋白Ⅱ（Coatomer proteinⅡ,COPⅡ）和细胞自噬途径在CSFV胞内转运和释放中的作用,并通过探究CSFV在培养细胞中传播方式的多样性以及传播介质的鉴定,揭示CSFV利用COPⅡ-自噬体-细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）转运和传播的机制,获得了以下结果。（1）猪瘟病毒颗粒通过COPⅡ介导的转运途径从内质网（endoplasmic reticulum,ER）输出。利用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）和Western blot检测CSFV感染仔猪的脾、肾、扁桃体、小肠中COPⅡ蛋白的差异表达,结果显示CSFV的感染促进Sar1b、Sec23、Sec13和Sec31A的表达。通过Sar1b突变抑制COPⅡ的组装和转运,发现CSFV感染后首个复制周期内RNA的复制没有显著变化,但是子代病毒的感染性和滴度极显著降低（P＜0.01）。激光共聚焦结果显示Sar1b的突变导致猪瘟病毒E2蛋白与ER共定位程度增加;透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察结果显示正常细胞中猪瘟病毒颗粒在ER外表面聚集,Sar1b的激活突变导致聚集于ER的病毒颗粒明显增多,失活突变导致病毒颗粒在ER的组装受阻,提示COPⅡ参与CSFV的组装和转运。最后,通过免疫沉淀分离COPⅡ囊泡,发现其中包含猪瘟病毒颗粒,表明COPⅡ囊泡是猪瘟病毒颗粒从ER输出的载体。（2）猪瘟病毒通过衣壳蛋白结合Sec24A进入COPⅡ囊泡。通过Sar1b与生物素连接酶融合表达,建立了捕获COPⅡ组分蛋白和货物蛋白的生物素邻近标记（proximity labeling,PL）方法。通过链霉亲和素pull-down试验和链霉亲和素荧光试验,验证了Sar1b-Bio ID2介导的PL方法对COPⅡ组分蛋白和货物蛋白标记的特异性。通过PL分析CSFV蛋白对COPⅡ转运的依赖性,发现CSFV结构蛋白C、Erns、E2以及非结构蛋白NS5A与COPⅡ转运相关。通过激光共聚焦检测C、Erns、E2和NS5A与COPⅡ蛋白的定位关系,发现囊膜蛋白E2和衣壳蛋白C分别与Sec24A有明显共定位。免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）试验结果显示衣壳蛋白C与Sec24A结合,说明CSFV衣壳通过结合Sec24A进入COPⅡ囊泡。（3）细胞自噬途径参与CSFV的胞内转运和释放。通过sh RNA和Sar1b突变抑制COPⅡ转运,发现CSFV感染诱导的自噬水平显著降低（P＜0.05）。自噬通路激活剂Rapamycin促进CSFV的释放,而抑制剂3-MA（3-methyladenine）和Wortmannin抑制CSFV的释放。同时,通过小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）抑制自噬蛋白BECN1和LC3B的表达,则导致CSFV的释放水平极显著降低（P＜0.01）,说明CSFV的释放受细胞自噬途径的调控。TEM观察发现猪瘟病毒颗粒聚集于自噬样囊泡,说明自噬体参与CSFV胞内转运。溶酶体酸性中和剂氯喹（Chloroquine,CQ）能极显著抑制CSFV的释放（P＜0.01）;通过激光共聚焦观察CSFV感染细胞中报告质粒m Cherry-GFP-LC3B的荧光分布、自噬体和溶酶体的共定位以及CSFV和溶酶体的共定位,发现CSFV定位于溶酶体并诱导自噬体和溶酶体的融合,表明自噬溶酶体的形成参与CSFV的转运和释放。（4）猪瘟病毒借助自噬源EVs以中和抗体抵抗性的方式在细胞间传播病毒颗粒。通过低熔点琼脂糖和中和抗体限制病毒的自由传播,并对比CSFV传播效率和细胞分裂速率,发现CSFV能够以cell-to-cell的方式从感染细胞传递到未感染细胞。通过Transwell阻断细胞间接触、病毒液反复冻融破坏囊泡结构、差速离心分离EVs以及TEM观察,发现CSFV通过EVs释放和传播病毒颗粒。用凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography,GFC）试验纯化包含猪瘟病毒颗粒的EVs,发现该EVs中含有自噬蛋白LC3B和BECN1。同时,用免疫沉淀分离LC3B阳性的EVs,通过多种试验手段分析显示该囊泡中包含CSFV的RNA和囊膜蛋白,并具有CSFV感染性,说明包含猪瘟病毒颗粒的EVs源自细胞自噬。通过自噬调节剂和si RNA介导的自噬通路激活或抑制,发现CSFV感染细胞释放的EVs感染性随着自噬通路的激活而增强,随着自噬通路的抑制而减弱,表明EVs介导的CSFV释放和传播受细胞自噬调控。综上所述,本研究发现CSFV利用COPⅡ组装机制在内质网形成感染性颗粒,病毒颗粒进入COPⅡ囊泡通过早期分泌途径离开内质网并运输到达自噬体和自噬溶酶体,最后通过细胞外囊泡离开宿主细胞并传播到其他细胞。研究结果增加了对CSFV转运、释放和传播的了解,为阐明CSFV的增殖和致病机制提供了新的科学资料。