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目的:筛选出干预脉络膜新生血管(CNV)可能有效的中药,进一步研究其作用及机理。
方法:
第一部分:鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法检测加减大黄(廑)虫丸等复方及单味中药对CAM血管生成的影响。
第二部分:采用MTS比色法,观察不同浓度的加减大黄(廑)虫丸等复方及单味中药对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)、猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)和人视网膜色素上皮(RPE)细胞(CRL-2302)细胞增殖的影响。
第三部分:Transwell小室检测不同浓度的加减大黄(廑)虫丸和复方血栓通对体外培养的ECV-304、RF/6A和CRL-2302细胞移行的影向。
第四部分:Matrigel实验检测不同浓度的加减大黄(廑)虫丸和复方血栓通对体外培养的ECV-304、RF/6A细胞内皮管腔形成的影响。
第五部分:运用Western Blot和实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,检测加减大黄(廑)虫丸对体外培养的RF/6A和CRL-2302细胞表达VEGF和基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白和mRNA的影响。
结果:
第一部分:中、低浓度的加减大黄(廑)虫丸、复方血栓通,高、中浓度的虻虫、地鳖虫,高、中、低浓度的水蛭,高浓度的鼠妇、蛴螬能够抑制鸡胚CAM血管生成。
第二部分:0.05、0.1和0.2 g/ml浓度的加减大黄(廑)虫丸对VEGF诱导的ECV-304和CRL-2302细胞增殖都具有抑制作用;只有0.2 g/ml浓度的加减大黄(廑)虫丸对VEGF诱导的RF/6A细胞增殖具有抑制作用。1.5625-100 mg/ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的ECV-304细胞增殖具有抑制作用;0.78125-25 mg/ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的RF/6A细胞增殖具有抑制作用;1.5625-200 mg/ml浓度的复方血栓通对VEGF诱导的CRL-2302细胞增殖具有抑制作用。
第三部分:12.5、25和50mg/ml浓度的加减大黄(廑)虫丸对ECV-304、RF/6A和CRL-2302细胞移行具有抑制作用;3.125、6.25和12.5 mg/ml浓度的复方血栓通对ECV-304和CRL-2302细胞移行具有抑制作用,6.25和12.5 mg/ml浓度的复方血栓通对RF/6A细胞移行具有抑制作用。且二药都随浓度增大,抑制作用增强。
第四部分:25和50mg/ml浓度的加减大黄(廑)虫丸对ECV-304细胞内皮管腔形成具有抑制作用,12.5、25和50 mg/ml浓度的加减大黄(廑)虫丸对RF/6A细胞内皮管腔形成具有抑制作用;0.390625、0.78125和1.5625 mg/ml浓度的复方血栓通对ECV-304和RF/6A细胞内皮管腔形成都具有抑制作用。且二药都随浓度增大,抑制作用增强。
第五部分:一定浓度的加减大黄(廑)虫丸具有抑制RF/6A和CRL-2302细胞VEGF和MMP-2蛋白和mRNA表达的作用。
结论:加减大黄(廑)虫丸和复方血栓通具有明显抑制血管生成的作用;可能通过抑制脉络膜血管内皮细胞增殖、移行和管腔形成,以及抑制RPE细胞增殖、移行的途径抑制CNV形成;加减大黄(廑)虫丸抑制脉络膜血管内皮细胞和RPE细胞VEGF和MMP-2的表达可能是其重要的作用机理之一。