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目的:采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)对本院妇产科就诊的因自然流产或死胎而终止妊娠的100例孕妇的绒毛及胎儿组织进行13、16、18、21、22、X和Y染色体数目异常检测,染色体探针包括为CSP18/CSPX/CSPY探针组,GLP13/GLPZI探针组,GLP16/GLP22探针组,探讨自然流产或死胎组织染色体数目异常的发生率及异常发生种类;比较各怀孕时间段(妊娠早期、中期、晚期)的染色体异常发生结果;探讨年龄、自然流产史与染色体数目异常发生率关系。本研究对于明确自然流产或死胎死产原因具有重要的临床意义,并为指导下一胎妊娠提供遗传资料。方法:1 B超诊断自然流产或死胎的发生研究对象主要症状有停经后阴道流血,下腹隐痛,子宫及附件区压痛,宫颈举痛等。采用GE-E8型彩色多普勒型超声诊断仪探测子宫轮廓、大小、盆腔、宫腔内及附件区等情况,根据妊娠囊着床部位、形态大小、胎芽胎心搏动或胎儿大小、胎盘及羊水情况等,判断是否为异常妊娠或死胎。2人工流产术、钳刮术、死胎引产术人工流产术:采用芬太尼联合丙泊酚静脉麻醉,术中予常规供氧并监测心律呼吸、血压和血氧饱和度。通过显示屏观察并引导吸引管方向及深度,待吸刮出孕囊及附属物后,检查吸出物可见绒毛组织。钳刮术:手术麻醉、术时监测同人工流产术。患者术前3小时阴道放置或口服米索前列醇200μg。在超声引导下卵圆钳进入宫腔后,夹住妊娠组织,向外牵拉。术者通过显示屏观察并引导手术器械方向及深度,观察手术全过程,可将妊娠组织物清除。死胎引产术:a.利凡诺羊膜腔内注射法:患者取仰卧位,先用B超定位穿刺点,用腰穿针从穿刺点垂直进针,进入羊膜腔内。将利凡诺50~100mg注入羊膜腔内。b.米索前列醇引产术:米索前列醇25~50μg放入阴道后穹隆,根据宫缩情况每3~4小时重复一次,24小时总量不超过150μg。观察产程,产后仔细检查胎盘、脐带、胎儿。3标本取材处理早期自然流产选择绒毛作为实验标本,死胎病例选择肌肉等组织作为标本。无菌条件下,用小剪刀去掉蜕膜组织,取实验组织大小约0.5 cm×0.5 cm,约20~25 mg,尽可能剪碎,注意尽量避免母体细胞污染。将新鲜标本用生理盐水洗净,4℃保存不超过四天,处理至固定液的标本-20℃保存不超一个月。4玻片制备将约5 mg已处理好的实验标本,加入0.075M KCL溶液5 ml(KCL溶液已预热至37℃),37℃条件下低渗15 min,期间轻轻吹打细胞悬浮2次,后离心吸弃上清;沿壁缓慢加2.5 ml固定液(冰乙酸:甲醇=1:3),缓慢吹打悬浮细胞,后离心吸弃上清;加入固定液5 ml先后进行两次固定,离心吸弃上清;加入冰醋酸1 ml进行消化2min,随即加入甲醇4 ml进行消化终止,后离心吸弃上清;最后根据管底的细胞量多少加入适量的固定液,轻轻吹打悬浮细胞,后每个标本滴3张玻片,供FISH杂交备用。5 FISH检测FISH探针购自北京金菩嘉公司,按荧光原位杂交试剂盒提供的说明书操作,将制备好的玻片先后进行2×SSC(p H7.0)溶液漂洗、0.08 mg/ml胃蛋白酶消化、乙醇脱水干燥、75℃变性,42℃杂交16 h,洗片,采用DAPI复染,后在Olympus BX5型荧光显微镜下观察,图像由JENOPTIK(Prog Res MFcool)冷CCD采集,采用Video Test-FISH2.0软件分析杂交信号。6结果判读GLP13/GLP21探针组经FISH检测在正常细胞核中显示信号为2红,2绿;CSP18/CSPX/CSPY探针组则显示2蓝、1绿、1红(男性),或2天蓝、2绿(女性);GLP16/GLP22探针组显示2绿和2红。每组探针需要计数至少100个细胞,单独判断每种染色体异常与否的指标,若正常指标的比例>90%,异常比例<10%,则该指标无异常;若某指标的异常比例>60%,则提示该指标异常;若某指标的异常细胞比例介于10%~60%间,则提示为嵌合体,应再计数50个细胞,计算异常比例。7数据统计分析采用软件SPSS 18.0进行数据分析,计数资料采用χ2检验,计量资料采用均数±标准差(χ±?)表示,组间比较应用t检验,以P<0.05表示结果差异有统计学意义。结果:1病例诊断及调查结果获得100例病例组织,均为单胎,宫内妊娠。其中绒毛标本96例,肌肉标本4例,平均年龄28.24±5.24岁,平均孕周11.24±4.06,平均既往自然流产次数1.74±0.96。2 FISH检测染色体异常病例对100例自然流产(其中不全流产者21例,均<12周)及死胎组织中13、16、18、21、22、X及Y染色体的异常情况进行FISH检测分析,检测成功率为100%,包括阳性结果45例,异常率为45%,阴性结果为55例。3 FISH检测染色体异常类型染色体异常的45个病例中,主要包括16三体(9例,20.00%),XO(8例,17.78%),三倍体XXY(8例,17.78%),22三体(4例,8.89%)和13三体(4例,8.89%)。4各妊娠时间段自然流产的染色体异常结果按照孕妇流产及死胎引产时的怀孕时间不同,将100例病例分为三组进行检测,68例为早期妊娠,22例为中期妊娠和10例晚期妊娠,三组染色体的数目异常发生率分别为60%、35.55%和4.44%,三组间染色体异常发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。5自然流产史与染色体异常发生率的关系根据孕妇既往自然流产次数的不同,将100例病例分为3组,58例无自然流产史者,21例1次自然流产者,≥2次自然流产者为21例,三组染色体异常病例人数分别为23、11和11,染色体的数目异常率分别为39.65%、52.38%和52.38%,三组间染色体的异常发生率差异无统计学意义(P>0.05)。6年龄与染色体数目异常发生率关系按照孕妇年龄将100例病例分为2组,14例年龄≥35岁,86例年龄<35岁,两组染色体异常病例人数分别为10和35,染色体异常率分别为71.43%和40.70%,两组间染色体异常率的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1 FISH检测100例样本全部成功,检出染色体数目异常病例45例,异常率45%,异常类型主要为16三体(20.00%),XO(17.78%)和XXY(17.78%)。2孕妇早、中、晚期妊娠三阶段自然流产及死胎的发生率分别为60%、35.55%和4.44%,组间的染色体异常率差异并无统计学意义(P>0.05),但提示流产孕周越早,胚胎染色体的异常发生率就会越高。3孕妇既往不同自然流产次数(0次、1次和≥2次)组间染色体异常发生率的差异并无统计学意义(P>0.05)。4孕妇不同年龄组间(<35岁和≥35岁)染色体异常发生率的差异有统计学意义(P<0.05)。5染色体数目异常是导致自然流产的重要因素,FISH技术是一种快速准确的分子诊断技术,对于明确自然流产原因具有重要意义。