论文部分内容阅读
第一部分构建乳腺癌MDA-MB-435s放射抵抗株模型目的：研究端粒结合蛋白PTOP和TRF1（Telomere repeat binding factor1）在乳腺癌细胞中对放射抗拒的作用,首先需要建立以乳腺癌细胞为基础的放射抵抗株模型。通过筛选MCF-7,MDA-MB-231以及MDA-MB-435s细胞后,决定以MDA-MB-435s乳腺癌细胞为亲本细胞。拟通过给予不同剂量的6MvX射线照射,建立两株稳定的乳腺癌放射抵抗株MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6。方法：运用德国西门子直线加速器分别以2Gy／次、6Gy／次的6MV X射线照射MDA-MB-435s亲代细胞,次日给予细胞生长培养基换液处理。待细胞生长至80%-90%时再次照射细胞,直至总剂量达60Gy。照射完成的细胞株稳定传代至少八代,并与亲本细胞MDA-MB-435s细胞一起,拟定在第一代、第五代、第八代分别行克隆形成实验以检测其是否具有稳定的放射抵抗性。结果：MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6细胞株在完成6Mv X射线总量为60Gy的照射后,稳定代传至第八代,并分别在第一、第五、第八代行克隆形成实验。两株细胞的克隆形成曲线均较MDA-MB-435s亲代细胞的曲线高,证实其放射抵抗性明显高于亲本细胞。SF2、Dq, DO等放射生物学特性均较MDA-MB-435s亲代细胞有显著改变（p<0.05）,更进一步显示其较亲本细胞而言的放射抵抗性及稳定性,放射抵抗株模型建立成功。结论：在以MDA-MB-435s乳腺癌细胞为亲本细胞的基础上,给与不同分次剂量的照射而构建的放射抵抗株MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6不仅具有与亲代细胞相同的生物学特性,经射线照射后获取明显的放射抵抗性并且能够稳定传代,更为第二部分端粒结合蛋白的研究奠定了基础。第二部分端粒结合蛋白PTOP和TRF1在乳腺癌放射抵抗株的表达及相关端粒功能的检测目的：端粒结合蛋白PTOP在国内外报道中指出在其他肿瘤细胞的放射抵抗株中呈现的是高表达的趋势,而TRF1则存在争议,在大多数文献中以端粒长度的负调控因子被提及,但也有部分文献提出相反的观点,认为TRF1是正调控因子。利用构建的MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6乳腺癌放射抵抗株模型,了解端粒结合蛋白PTOP和TRF1的表达情况,以及在这些端粒结合蛋白高表达的细胞株中其端粒长度、端粒酶活性等的变化情况。方法：运用Western Blot和RT-PCR方法检测MDA-MB-435s乳腺癌细胞及其MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6乳腺癌放射抵抗细胞株中端粒结合蛋白PTOP和TRF1在蛋白和mRNA水平上表达的变化情况。运用端粒酶活性试Elisa剂盒以及Southern blot技术分别检测三株细胞的端粒酶活性和端粒长度,了解其变化情况。结果：在MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6乳腺癌放射抵抗细胞株中,端粒结合蛋白PTOP和TRF1无论在蛋白还是mRNA水平上的表达显著高于亲本MDA-MB-435s乳腺癌细胞。并且MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6乳腺癌放射抵抗细胞株中的端粒酶活性较MDA-MB-435s乳腺癌亲本细胞细胞有显著地提高（P<0.05）。而在端粒长度方面,MDA-MB-435s R60/2细胞株的端粒限制性片段长度TRF （terminal restriction fragment）大致为5.3-6.3kbp,是亲本细胞MDA-MB-435s的1.3-1.75倍（亲本细胞TRF长约3.6-4.2kbp）;另一株MDA-MB-435s R60/6放射抵抗细胞TRF约长7.2-8.6kbp是亲本细胞的2-2.4倍。这些结果说明了高表达的端粒结合蛋白与放射抵抗性、端粒长度以及端粒酶活性之间有着密切的相互作用。结论：在第一部分成功构建的MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6乳腺癌放射抵抗细胞中,我们发现端粒结合蛋白PTOP和TRF1较亲本细胞MDA-MB-435s存在着明显高表达的现象。与此同时,这些端粒结合蛋白高表达细胞株的端粒长度、端粒酶活性也发生了具有统计学意义的改变。更进一步地说明了端粒结合蛋白PTOP和TRF1对端粒长度、端粒酶活性甚至是放射抵抗性均存在积极的作用。第三部分沉默端粒结合蛋白PTOP后对放射抵抗性以及端粒酶活性影响的实验研究目的：在第二部分的试验中,我们验证了端粒结合蛋白PTOP和TRF1对放射抵抗性、端粒长度以及端粒酶活性均有积极的影响。基于这样的实验发现,我们选取了端粒结合蛋白PTOP作为进一步的研究对象,运用慢病毒lentivirus技术沉默该蛋白表达后再次检测放射抵抗株MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6的放射抵抗变化以及端粒酶活性的变化情况。方法：选取靶序列5’-GTGGTACCAGCATCAGCCT-3’送上海吉凯基因公司进行慢病毒质粒构建。制备好的慢病毒质粒进行测序检验。筛选出最佳MOI值后,将慢病毒质粒感染到MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6放射抵抗株中,被感染的细胞命名为60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi。将这两株细胞分别行Western blot检测慢病毒感染效率。利用克隆形成实验检测新细胞株60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi与之前的放射抵抗株MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6R及亲本细胞MDA-MB-435s的放射抵抗变化情况。最后使用端粒酶活性试剂盒检测新感染的细胞株是否因沉默PTOP基因后改变了端粒酶活性。结果：构建的慢病毒质粒经测序鉴定正确后,根据最适的MOI值将慢病毒质粒感染到MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6放射抵抗株中得到60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi细胞株,收集细胞后行Western blot和RT-PCR检测后显示慢病毒感染效率达到90%左右,基因沉默效果可。将新得到的60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi细胞株与之前的MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6放射抵抗株以及亲本细胞MDA-MB-435s行克隆形成实验检测其放射抵抗变化情况。结果显示,慢病毒感染后的细胞株60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi较之前的放射抵抗株MDA-MB-435s R60/2和MDA-MB-435s R60/6放射抵抗性明显降低,但仍然高于亲本细胞MDA-MB-435s。而端粒酶活性实验也表明,慢病毒感染后60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi细胞株,其端粒酶活性也有一定程度的降低。结论：通过慢病毒技术成功沉默端粒结合蛋白PTOP后,得到新的细胞株60/2PTOP RNAi和60/6PTOP RNAi,其在放射抵抗性方面经验证较之前的放射抵抗株MDA-MB-435sR60/2和MDA-MB-435sR60/6有明显的降低,但仍高于亲本细胞MDA-MB-435s。另一方面,在端粒酶活性的水平上,沉默后的细胞株的端粒酶活性有一定程度的降低。这直接说明,端粒结合蛋白PTOP与乳腺癌细胞的放射抵抗及端粒酶活性有着密切的联系。