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研究背景实体器官移植是治疗终末期器官衰竭最有效的治疗方式,随着免疫抑制剂的发展,肾移植的5年存活率已得到显著改善,肝脏移植的远期疗效也取得长足进步。但现行的免疫抑制剂仍存在众多副作用,包括促使感染性疾病的发生,以及诱发移植后糖尿病,高血压,高血脂等,这些因素都影响患者生存质量,同时阻碍了受者、移植物的长期存活,而诱导免疫耐受是器官移植后最理想的一种存在方式。诱导对移植物的特异性耐受后可以减少抗排斥药的使用,避免各种毒副作用,延长受者,移植物的长期存活。目前树突状细胞（DC）是一类最具有潜力的运用于诱导免疫耐受的细胞,最初DC被认为是体内最强的抗原提呈细胞,诱导免疫应答,称之为反应性DC,新近又发现DC也可以诱导T细胞低反应性,这种DC被称作为调节性DC,但体内DC数量较少,且以反应性DC为主,如何体内外诱导耐受性DC的扩增,分化成为移植免疫耐受研究的热点。上世纪90年代以后利用细胞因子体外扩增DC的技术逐步成熟,从而为利用DC进行输注治疗提供了基础。研究目的采用小干扰RNA技术,体外制备RelB shRNA慢病毒,同时体外培养扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）, RelBshRNA慢病毒转染DC诱导耐受性树突状细胞的产生,对转染后的耐受性DC的表型,凋亡,分泌细胞因子,以及耐受性DC诱导T细胞反应性研究,以及诱导T细胞低反应性的机制研究。利用RelB shRNA制备耐受性树突状细胞移植前输注预防心脏移植排斥反应。研究方法1、RelBshRNA转染DC后DC生物学形态,功能的改变利用慢病毒载体系统构建RelB shRNA慢病毒载体,制备纯化慢病毒颗粒。实验分组：未成熟组（imDC组）,将获得的BMDC持续培养,避免LPS等外源性刺激；成熟DC组（mDC组）,将获得的BMDC进行培养,在第7天用LPS刺激成熟；干扰载体对照组（LucR siRNA DC组）,将获得的BMDC进行培养,于第5天感染干扰对照载体LucR-siRNA慢病毒,至第7天经LPS刺激成熟；RelB shRNA转染DC组（RelB shRNA DC组）,将获得的BMDC继续培养,于第5天感染Re1BshRNA’慢病毒颗粒,至第7天,经LPS刺激成熟。慢病毒感染DC的MOI为50,在MOI为50时,经荧光显微镜和流式细胞仪检测感染阳性率达到92%以上。LPS刺激成熟的浓度为50ng/ml。RT-PCR和Western-blot检测转染后DC中RelB的表达；利用流式细胞仪检测DC凋亡率以及DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；ELISA检测转染后的DC分泌的细胞因子IL-10, IL-12, TGF-β1; ELISA检测转染后的DC胞核NF-KB各亚基的DNA结合活性。2、RelB shRNA转染DC后诱导T细胞低反应性研究利用RelB shRNA慢病毒转染DC获得耐受性树突状细胞。RelB shRNA-DC同同种抗原特异性T细胞（BABL/C来源）进行混合淋巴细胞反应（第1次MLR）,将第1次MLR获得的T细胞同相同特异性抗原以及第三方抗原来源（C3H来源）的DC进行第2次MLR, MTT法检测两次MLR后T细胞增殖能力,ELISA检测第1次MLR后分泌的细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-10和IL-4水平；流式细胞仪检测反应后T细胞凋亡率以及T细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比率。3、RelB shRNA-DC移植前输注预防心脏移植急性排斥反应建立小鼠腹部心脏移植模型,实验分为4组,每组10只小鼠,未输注组：受体BABL/c小鼠心脏移植前后无任何特殊处理；不成熟组：受体BABL/c小、鼠心脏移植前7d经尾静脉输注培养7d但未作其他处理的DC（体外不成熟DC）；空载体组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的空载体转染DC; RelB shRNA组：受体BABL/c小鼠心脏移植前7d经尾静脉输注供体C57BL/6小鼠来源的RelB shRNA转染DC。观察移植后小鼠心脏存活时间；移植后7天各组各取2只小鼠,切除移植物,行HE染色检测排斥反应程度。结果1、相比于imDC组,mDC组,LucR siRNA DC组,RelB shRNA DC组低表达RelB mRNA和RelB蛋白；RelB shRNA DC组的凋亡率同其余三组无差异；MB shRNA可下调DC表型分子MHC-2, CD80, CD86, CD83的表达；转染后的DC低表达IL-12,高表达IL-10, TGF-β1表达无差异；RelB shRNA抑制了核内RelB的DNA结合活性,但不影响p50、p52、RelA （p65）、c-Rel的DNA结合活性。2、mDC组和LucR siRNA DC组有较强的刺激同种T细胞增殖能力,imDC组和RelB shRNA DC组DC刺激同种T细胞增殖能力明显减弱；RelB shRNA转染DC能诱导同种T细胞抗原特异性低反应性,但对第三方抗原无特异性地反应性。MLR后T细胞分泌低水平的IL-2,IFN-γ,分泌高水平的IL-10和IL-4；RelB shRNA-DC诱导T细胞凋亡率增加；诱导T细胞向CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化增加。3、小鼠心脏移植模型中,预先输注供体来源的RelB shRNA-DC可延长移植物存活时间,降低排斥反应发生程度。结论1、利用RelB shRNA慢病毒体外转染树突状细胞使MHC-2, CD80, CD86, CD83呈低表达,分泌抑制性细胞因子,而不影响DC存活以及其它功能。2、RelBshRNA慢病毒转染DC获得的耐受性DC诱导T细胞特异性低反应性,主要机制是诱导T细胞凋亡,诱导T细胞向调节性T细胞分化,分泌的细胞因子由Thl型向Th2型转变。3、在心脏移植模型中,移植前输注RelB shRNA-DC可预防移植物急性排斥反应,降低排斥反应程度,延长小鼠存活期。