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目的:地西他滨(Decitabine,DAC),即5-氮杂-2-脱氧胞苷酸。高浓度具有细胞毒作用,而在低浓度具有去甲基化效应。目前地西他滨已经用于治疗骨髓增生异常综合症(Myelodysplastic Syndrome,MDS)、急性髓系白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML),和其他恶性肿瘤。介导自然杀伤细胞(Natural Killer cell,NK)杀伤效应的一种共刺激分子-—D48可能受到DNA甲基化修饰的调控,并影响AML预后。我们前期通过甲基胞嘧啶脱氧核苷酸捕获测序(methylC-capture sequencing,MCC-Seq)以及生物信息学技术发现CD48分子的表达水平影响AML的预后。因此,地西他滨对CD48的调节作用及对AML的治疗和预后的影响值得进一步探索。方法:通过实时 QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,QPCR)、流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、免疫印迹法(Western blotting)等方法,检测DAC在mRNA(Messenger RNA,mRNA)平和蛋白水平对DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)和CD48的调控作用及二者相互的关系。流式细胞术检测NK细胞对不同浓度DAC处理的WEHI-3细胞的杀伤能力。构建小鼠白血病模型分为CON组、DAC组、DAC+anti-CD48组,并行NK细胞输注。比较各组小鼠生存期。采用苏木精-伊红染色法,即HE染色(hematoxylin-eosin staining)进行病理学分析,采用Ficoll分离液的方法得到外周血单个核细胞,采用别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)荧光素交联的抗小鼠NK细胞表面标志物CD49b抗体和亮紫421(Brilliant Violet 421,BV421)荧光素交联的抗小鼠脱颗粒毒性淋巴细胞标志物溶酶体相关膜蛋白-1(Lysosome-Associated Membrane Proteins,LAMP-1/CD107a)抗体染色,标记NK细胞并检测其活性,通过流式细胞仪检测CD107a 阳性细胞占比以检测体内NK细胞杀伤活性变化。结果:MCC-seq结果显示AML患者中CD48甲基化水平相较于正常人更高,并在经DAC治疗后CD48甲基化水平下调,生物信息学分析的结果显示AML患者的CD48mRNA表达明显较正常人低(P<0.01),且经地西他滨治疗10天后,其甲基化程度明显降低(P<0.0001),同时CD48 mRNA表达水平上升,数据库分析显示CD48high AML患者的总体生存期(Overall survival,OS)以及无事件生存期(Event-free survival,EFS)均明显长于CD48lowAML患者。体外细胞实验结果显示DAC能够上调人源SKNO-1、KASUMI细胞系以及小鼠EL-4、WEHI-3细胞CD48 mRNA表达水平,差异具有统计学意义(P<0.01);流式细胞术结果显示DAC可上调四种细胞表面CD48蛋白表达水平;WB结果显示WEHI-3、SKNO-1细胞经地西他滨刺激后,CD48蛋白表达升高且DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达水平下降,二者表达水平呈负相关。NK细胞杀伤实验结果显示NK细胞对DAC处理后细胞的杀伤效率高于对照组(P<0.001)。加入抗鼠CD48封闭抗体后,对照组细胞与DAC处理组细胞占比由52.7%和44.1%变为48.0%和48.4%,表明加入抗鼠CD48抗体后NK细胞对DAC处理后的WEHI-3细胞杀伤效应明显降低(P<0.001)。动物实验结果显示DAC组相较于对照组(P<0.05),DAC+anti-CD48组脾脏重量大于DAC组(P<0.05)。DAC组相较于对照组,白血病髓外浸润所致的肝脏结节数量明显减少,覆盖区域明显局限。而DAC+anti-CD48组相较于DAC组结节数量较多,覆盖区域较大,但与对照组相比结节数量较少,覆盖区域较为局限。脾脏石蜡切片HE染色结果显示对照组中脾脏结构紊乱、红髓中异常深染核质比高的细胞增多、脂肪性坏死细胞增多以及生发中心减小甚至消失。其异常表现严重程度为对照组>DAC+anti-CD48组>DAC组。肝脏石蜡切片HE染色结果显示对照组、DAC+anti-CD48组、DAC组中都有着深染且核质比高的肿瘤细胞,其浸润范围大小为对照组>DAC+anti-CD48组>DAC组。DAC组中CD107a 阳性细胞比例为11.4%,对照组CD107a 阳性细胞比例为2.48%,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。DAC+anti-CD48+组中的CD107a 阳性细胞比例为5.76%(P<0.05),DAC组相较于对照组组小鼠生存时间明显延长(P值<0.0001),在加入抗鼠anti-CD48抗体后,DAC+anti-CD48组小鼠生存期相较于DAC组明显缩短(P=0.0019)。结论:地西他滨通过下调CD48 DNA甲基化水平来上调其表达,增强NK细胞与AML细胞的亲和性,从而增强NK细胞对AML细胞的毒性杀伤作用。地西他滨上调CD48并联合NK细胞输注能够降低肿瘤负荷并延长AML小鼠生存期。在我们采用的AML动物模型中,也证明了地西他滨可以上调白血病细胞CD48分子,增强NK细胞的杀伤作用。去甲基化药物联合NK细胞输注为AML的免疫治疗提供了新的治疗策略