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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,严重影响了禽类养殖业的发展。APEC能通过呼吸道进入禽体内,并在下呼吸道粘附、定植,其分泌的毒素能引起禽类急性败血症和多脏器的损伤。由于APEC血清型多,耐药机制复杂,导致APEC病难以防控。生物被膜对APEC的致病性具有重要的调控作用。生物被膜(Biofilm,BF)是细菌粘附于物质表面,并通过胞外基质包裹,形成具有严密结构性的多细胞群体形态。BF的形成受诸多因素调控,其中群体感应系统和环二鸟苷酸(c-di-GMP)是主要的两种调控方式。在本研究中,为进一步研究群体感应系统和c-di-GMP是如何调控APEC的生物被膜的形成,进而影响其生物学特性。本研究通过筛选参与APEC生物被膜形成的c-di-GMP代谢基因,同时开展群体感应系统对APEC生物被膜形成的研究,初步研究了 c-di-GMP与群体感应调控APEC生物被膜形成的调控机制,为从c-di-GMP与群体感应系统角度开展APEC的防控提供参考。1.c-di-GMP代谢基因yegE的功能验证及其对APEC生物学特性的影响c-di-GMP是细胞内通用的第二信使,能调控细菌的多种生物学特性,如毒力,生物被膜形成,运动性,耐药性以及细胞形态及周期等。本实验室前期研究结果表明,在APEC临床分离株DE17中鉴定了 27个c-di-GMP代谢基因。通过构建不同c-di-GMP代谢基因缺失株,筛选到yegE基因参与调控DE17生物被膜形成。对yegE的编码氨基酸序列分析,表明其含有GGEEF结构域。通过构建pET28b-yegE表达载体,电转化至含双荧光质粒的菌株BL21(DE3)-atr中,在0.5 mM的IPTG诱导后,荧光显微镜下观察,能产生绿色和红色荧光。而无IPTG诱导的菌液显示绿色,表明基因yegE具有c-di-GMP合成酶功能。利用同源重组,成功获得yegE的DE17缺失株(DE17AyegE),对其生物学特性检测结果表明,与野生株相比,yegE能显著降低DE17的生物被膜的形成能力(p<0.01),其运动性显著增强(p<0.05),并改变了其rdar形态。但对其生长性能、耐药性没有显著影响。荧光定量PCR结果显示,与野生株相比,缺失株生物被膜相关基因自黏附素agn43的转录水平显著降低了约5倍,胞外多糖合成亚基pgaD上调了 2.2倍,鞭毛转录调控因子flhC和鞭毛合成蛋白flhA的转录水平分别上调了 3倍和9.6倍。胞外多糖合成亚基pgaA、膜外多糖输出蛋白wza及鞭毛马达开关蛋白fliM转录水平无变化。本研究结果表明yegE基因作为c-di-GMP合成酶,参与调控DE17的生物被膜形成,本研究为进一步开展c-di-GMP代谢基因调控APEC生物被膜形成的分子机制提供基础。2.I型群体感应系统对APEC的生物学特性的调控作用研究表明,在大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌中存在I型群体感应信号分子AHLs 受体蛋白 SdiA(Suppressor of division inhibitor,SdiA),但缺少 AHLs 信号分子合成基因lasI。为了研究I型群体感应系统对APEC的调控作用,本研究通过在APEC中过表达铜绿假单胞菌合成AHLs合成基因lasI,在DE17中构建I型群体感应系统,研究野生株与重组菌株(DE17-lasI)的生物学特性的变化。研究结果表明,与野生株DE17相比,重组菌株(DE1 7-lasI)生物被膜形成能力与运动性显著降低(p<0.01),并改变其rdar形态,但对其生长特性以及耐药性无显著影响。荧光定量PCR结果表明,与野生株相比重组菌株DE17-lasI的AHLs受体基因sdiA转录水平上调了约9倍;与生物被膜形成相关的自黏附素agn43转录水平下调约4倍;与运动性相关基因鞭毛转录激活因子flhC下调了 2.5倍;与毒力相关的菌毛粘附素亚基fimH上调了约60倍,而促血清存活蛋白iSS及外膜蛋白ompA等毒力基因转录水平分别下调了 21.7倍和4.4倍。本研究表明,I型群体感应系统负调控DE17的生物被膜形成,参与调控DE17的部分生物学特性,本研究为进一步开展I型群体感应系统对APEC的调控作用提供参考。3.LuxS/AI-2型群体感应系统通过调控c-di-GMP代谢基因yeaP,调控APEC生物被膜的形成本实验室前期研究表明,LuxS/AI-2型群体感应系统与c-di-GMP均可调控细菌的生物被膜形成。为了探讨LuxS/AI-2型群体感应系统是否可通过调控c-di-GMP代谢基因实现对APEC生物被膜的调控作用,本研究通过构建luxS与不同c-di-GMP代谢基因的单缺失与双缺失株,筛选对DE17生物被膜形成有影响的缺失株,鉴定受LuxS/AI-2型群体感应系统调控的c-di-GMP代谢基因。研究结果表明,与野生株DE17相比,luxS及yeaP基因单缺失株均不影响其生物被膜形成,但双基因缺失株DE17 AluxSΔyeaP生物被膜形成能力显著提高(p<0.01),运动性显著降低(p<0.05),但不影响其生长及耐药性。自溶解试验结果和胞外eDNA定量结果显示,双基因缺失株和单基因缺失株与野生株之间没有差异。对双基因缺失株进行透射电镜观察,结果表明双缺失株的菌毛数量降低,鞭毛数量增多。激光扫描共焦显微镜显示双基因缺失株生物被膜内的细菌数量明显多于野生株和单基因缺失株。荧光定量PCR结果显示,与野生株相比,双基因缺失株的agn43、wza和bcsA的转录水平分别上调5.7倍、22.5倍和12.6倍。而pgaD、csgD和fimC的转录水平分别下调1.7倍、7.6倍及2.4倍。血清杀菌试验、体内分布及DF-1细胞粘附与入侵试验评价缺失株和野生株毒力变化。结果表明,缺失yeaP,其血清杀菌、体内分布、与黏附与入侵等试验都没有显著变化,表明其对DE17的毒力无显著影响。但双基因缺失株DE17ΔluxSΔyeaP与野生株相比,其存活数在50%的补体存在时显著降低(p<0.05),且存在浓度依赖性。此外,与野生株及单基因缺失株DE17AyeaP相比,其在肝脏、脾脏组织组织内存活数量及对DF-1细胞的黏附能力也显著降低(p<0.01),表明yeaP能促进缺失luxS基因所导致的减毒作用。本研究结果表明,LuxS/AI-2型群体感应系统能够通过调控c-di-GMP代谢基因yeaP,调控DE17的生物被膜的形成,为进一步开展LuxS/AI-2型群体感应系统与c-di-GMP代谢基因对APEC的生物被膜的调控机制奠定基础。