论文部分内容阅读
目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,其中一半以上为预后极差的恶性胶质瘤,通过现有的手术切除、放射治疗和化学药物等联合治疗,其临床疗效仍难以令人满意。脑胶质瘤给社会和家庭造成了巨大的负担,改善其治疗现状是目前迫切需要的。在近年来的研究中发现,免疫检查点分子在作为脑胶质瘤的治疗靶点中具有良好的前景,有望改善胶质瘤患者的预后。B7-H3(CD276)是肿瘤免疫检查点关键分子之一,在多种人类恶性肿瘤的发生、增殖和侵袭中起关键作用,并与肿瘤患者的不良预后相关。已有研究报道B7-H3亦与恶性胶质瘤的进展密切相关,但其具体作用及机制尚不清楚。因此,本研究希望明确二者之间的关系,以期为胶质瘤寻找新的治疗靶点提供依据。方法:1.采用免疫组化方法检测B7-H3蛋白在高级别胶质瘤和低级别胶质瘤肿瘤组织标本中的表达,并回顾性分析79例胶质母细胞瘤患者肿瘤组织标本中B7-H3的表达与患者生存时间的关系。2.通过B7-H3慢病毒转染胶质瘤细胞LN229,构建B7-H3稳定过表达胶质瘤细胞(LN229-B7-H3OE)和B7-H3沉默胶质瘤细胞(LN229-B7-H3 KO),并设置空载体对照细胞(LN229-B7-H3 Cas-9)。进行细胞培养,用于后续实验。3.通过CCK-8法、克隆形成实验,检测B7-H3过表达/沉默后胶质瘤细胞增殖能力及克隆形成能力的变化。4.通过Transwell侵袭试验,检测B7-H3过表达/沉默后胶质瘤细胞侵袭能力的变化。5.通过裸鼠皮下肿瘤模型观察B7-H3过表达/沉默后胶质瘤细胞体内成瘤能力的变化。6.通过蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胶质瘤细胞中B7-H3过表达后JAK2/STAT3信号通路及相关蛋白的表达情况,免疫荧光检测肿瘤组织中JAK2/STAT3信号通路的激活情况。7.使用FLLL32抑制B7-H3过表达胶质瘤细胞中JAK2/STAT3信号通路,进一步阐明JAK2/STAT3信号通路在B7-H3诱导的胶质瘤进展中的作用。结果:1.高级别胶质瘤肿瘤组织中B7-H3的表达明显高于低级别胶质瘤组织(P<0.05);在对79例胶质母细胞瘤患者的生存分析中发现,B7-H3过表达患者的无复发生存时间及总体生存时间较低表达患者明显缩短(均P<0.05)。2.过表达B7-H3的LN229-B7-H3 OE细胞的增殖能力较LN229细胞显著增强(P<0.01),沉默B7-H3的LN229-B7-H3 KO细胞的增殖能力较空载体LN229-B7-H3 Cas-9细胞明显下降(P<0.05)。3.克隆形成实验显示B7-H3过表达显著提高了LN229细胞的克隆形成能力(P<0.01),而沉默B7-H3后细胞克隆形成能力明显降低(P<0.05)。4.裸鼠皮下成瘤模型中,B7-H3过表达肿瘤细胞的体内成瘤能力明显强于载体细胞(P<0.05),沉默B7-H3后肿瘤细胞成瘤能力明显下降。5.Transwell试验表明过表达B7-H3后增强了肿瘤细胞的侵袭(P<0.01),沉默B7-H3后肿瘤细胞的侵袭受到抑制(P<0.05)。6.通过Western blot检测胶质瘤细胞B7-H3过表达后相关信号通路的激活情况。观察到在B7-H3过表达的胶质瘤细胞中,p-JAK2和p-STAT3的表达增强,并检测到了Src磷酸化增强,负调控因子SOCS3/SHP-1和其磷酸化形式减少。此外,采用免疫荧光在高级别胶质瘤患者的肿瘤组织中也观察到p-JAK2和p-STAT3的表达增强增强。表明胶质瘤中B7-H3的过表达诱导了Src的激活和下调负调控因子SOCS3/SHP-1激活JAK2/STAT3信号通路;同时还检测到EMT过程标志物N-cadherin表达升高,E-cadherin表达降低,提示EMT过程的发生。7.使用FLLL32抑制LN229-B7-H3 OE细胞中JAK2/STAT3信号通路后,观察到胶质瘤细胞的增殖、克隆形成能力降低(均P<0.01),体内成瘤能力和细胞的侵袭能力受到抑制(均P<0.05),E-cadherin和N-cadherin的表达逆转。表明JAK2/STAT3信号通路,参与了B7-H3诱导的胶质瘤细胞增殖、侵袭、肿瘤形成和EMT过程。结论:1.B7-H3在恶性胶质瘤组织中的表达升高,过表达的B7-H3可以在体外和体内显著促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭,导致临床预后不良。2.B7-H3通过激活JAK2/STAT3信号通路,促进胶质瘤的生长、细胞侵袭和EMT过程。3.B7-H3是胶质瘤的潜在治疗靶点,具有进一步研究的价值。