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食管癌是人类常见的消化道肿瘤，其发病率居世界恶性肿瘤的第8位，死亡率居第6位。我国位于食管癌高发地区，男性发病率高于女性，平均死亡年龄63岁。随着分子生物学研究的不断深入，发现食管癌的发生、发展是一个多基因、多因素、多阶段的进行性过程。近年来信号转导通路及抗肿瘤药物的作用机制成为研究重点，为临床治疗食管癌提供了方向。 P90核糖体S6激酶2(Ribosomal S6 kinase2，RSK2)是p90RSK蛋白家族的成员，同时也是细胞外调节激酶1/2(extracellularsignal-regulated protein kinases1and2，ERK1/2)下游重要的一级效应分子。活化的RSK2通过调节与增殖相关的糖原合成激酶3(Glycogensynthase kinase3β，GSK3β)、促凋亡蛋白BAD、与细胞迁移和侵袭相关的肌动蛋白Fascin-1等下游靶分子影响细胞的增殖、凋亡、侵袭与迁移。 Bufalin（蟾蜍灵）是我国传统中药蟾酥中的主要成分，属强心甙类物质，其分子式为C24H34O4，相对分子量为386.5。我们前期研究结果表明bufalin可以在体外抑制ERK的磷酸化，为进一步探讨其在体内的作用及对下游通路的影响，本实验以食管癌ECA109细胞为研究对象，并通过将ECA109细胞接种于裸鼠，建立食管鳞状细胞癌移植瘤，探讨bufalin通过ERK/RSK2通路对食管癌细胞及裸鼠移植瘤的影响。 目的:探讨Bufalin通过ERK/RSK2通路对ECA109细胞和裸鼠移植瘤作用的研究。 方法: 1使用CCK-8检测bufalin作用ECA109细胞不同浓度及时间的增殖抑制率。 2使用TUNEL标记法检测不同浓度的bufalin干预ECA109细胞各组的凋亡指数。 3使用划痕实验研究不同浓度bufalin对食管癌细胞迁移的影响;在此基础之上，利用Transwell小室实验检测bufalin对食管癌细胞侵袭与迁移的影响。 4建立裸鼠食管癌细胞移植瘤模型，观察模型组、bufalin低剂量组(BL，0.5mg/kg)、bufalin中剂量组（BM，1.0mg/kg）、bufalin高剂量组（BH，1.5mg/kg）、PD98059组(3.0mg/kg)、联合组(BP, bufalin+PD98059)裸鼠的体重来评价bufalin对裸鼠食管癌移植瘤的影响，并通过测量原位瘤的体积来检测bufalin的抑瘤作用。 5显微镜下观察各组的移植瘤组织学表现，TUNEL标记法检测裸鼠移植瘤的凋亡指数。 6实时定量PCR法检测裸鼠移植瘤中ERK及RSK2的mRNA的表达。 7 Westem blot方法及免疫组织化学方法检测裸鼠移植瘤中ERK1/2、RSK2、通路下游靶分子GSK3β、BAD蛋白表达及其磷酸化和Fascin-1的蛋白表达。 结果: 1 CCK-8结果显示以不同浓度bufalin(20、40、60、80、100 nmol/L)干预ECA109细胞24、36、48小时，增殖抑制率逐渐增高，提示bufalin以时间及剂量依赖方式抑制ECA109细胞的增殖。 2 TUNEL标记法显示凋亡指数随着bufalin的浓度增加(20、40、60、80、100 nmol/L)而逐渐升高(7.400±1.140，13.800±1.483，21.600±2.510，29.400±4.037，43.400±5.128)，呈剂量依赖性，bufalin40、60、80、100nmol/L组与阳性对照组(3.200±1.095)相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3划痕实验显示，实验组(bufalin20、40、60、80、100 nmol/L)迁移的距离分别为2.416±0.024，2.928±0.065，3.142±0.084，3.566±0.097，4.066±0.075，均大于阳性对照组（1.922±0.060），差异有统计学意义(P＜0.05)。提示bufalin可以以剂量依赖方式抑制ECA109细胞的迁移;Transwell小室迁移实验结果显示bufalin干预组(20、40、60、80、100nmol/L)穿膜细胞数分别为129.800±10.993，91.600±10.875，62.200±7.627，31.300±5.143，20.400±3.565，明显少于阳性对照组(146.200±11.923)，差异有统计学意义(P＜0.05);侵袭实验表明bufalin干预组(20、40、60、80、100 nmol/L)细胞穿破基质胶细胞数分别为86.500±10.967，74.300±4.398，55.100±7.109，38.100±6.008，28.400±3.658，同样少于阳性对照组(98.400±5.835)，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4成功建立36只裸鼠移植瘤模型。用药前后各组精神状态、活动能力，体重无明显差异。用药各组（BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组）裸鼠肿瘤体积分别为1.680±0.150cm3，1.285±0.134cm3，0.873±0.095cm3，0.815±0.108cm3，0.530±0.104cm3，明显比模型组(1.758±0.181cm3)减小，BM组、BH组、PD98059组、联合组与模型组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示了bufalin对食管癌原位移植肿瘤的生长具有抑制作用。 5各组裸鼠移植瘤组织学形态表现:在显微镜下观察各组裸鼠移植瘤HE病理染色切片，均为低分化鳞状细胞癌，细胞异型性较明显，细胞核大，深色较染，核仁突出明显，少见细胞间桥及细胞角化。各组肿瘤均有不同程度的坏死，坏死范围逐渐增大，以联合组最为明显。 6模型组、BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组的TUNEL凋亡指数分别为6.030±0.622％，11.020±0.694％，19.070±0.907％，25.060±1.397％，20.020±1.197％，17.070±0.738％。以BH组凋亡指数最高;BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组与模型组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 7实时定量PCR法结果显示:(1)模型组、BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组的ERK mRNA的△CT值分别为0.270±0.084，0.293±0.081,0.596±0.224,0.857±0.183,0.868±0.187,1.313±0.282;(2)模型组、BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组RSK mRNA的△CT值分别为0.340±0.062，0.337±0.071，0.642±0.226，0.915±0.170，0.923±0.176，1.413±0.269。ERK及RSK mRNA表达均呈降低趋势，BM组、BH组、PD98059组、联合组与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 8 Western blot结果显示:(1)各组ERK1/2、RSK2、BAD的蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05）;(2)模型组、BL组、BM组、BH组、PD98059组、联合组ERK1/2磷酸化蛋白水平分别为0.721±0.094，0.695±0.095,0.555±0.080,0.388±0.052,0.341±0.060,0.235±0.056,RSK2磷酸化蛋白水平分别为0.613±0.085，0.612±0.084，0.427±0.089，0.305±0.056，0.258±0.051，0.158±0.058。ERK1/2及RSK2的磷酸化水平呈降低趋势，BM组、BH组、PD98059组、联合组与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(3) GSK3β蛋白水平逐渐升高，GSK3β磷酸化、BAD的磷酸化和Fascin-1的蛋白水平均呈降低趋势，与模型组相比，BM组、BH组、PD98059组、联合组差异均有统计学意义(P＜0.05)。 9免疫组织化学结果显示:(1)各组ERK1/2、RSK2、BAD的蛋白水平差异均无统计学意义(P＞0.05);(2) ERK1/2磷酸化水平的免疫反应积分中位数分别为8，8，6，4，5，3。RSK2磷酸化水平的免疫反应积分中位数分别为8，8，5，3，3，1。ERK与RSK2蛋白水平呈降低趋势，BM组、BH组、PD98059组、联合组与模型组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05);(3) GSK3β蛋白水平逐渐升高，GSK3β磷酸化、BAD磷酸化和Fascin-1的蛋白水平均呈降低趋势，与模型组相比，BM组、BH组、PD98059组、联合组差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论: 1 Bufalin可以抑制ECA109细胞的增殖，促进其凋亡。 2 Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移和侵袭运动。 3 Bufalin对裸鼠的食管鳞状细胞癌移植瘤具有明显抑制作用。 4 Bufalin可通过抑制ERK1/2、RSK2磷酸化的水平，从而对裸鼠移植瘤的生长产生抑制作用。 5 Bufalin可能通过抑制GSK3β的失活抑制肿瘤的增殖，下调磷酸化的BAD发挥促凋亡作用，并通过下调Fascin-1发挥抑制肿瘤侵袭与迁移的作用。