研究背景肝再生现象见于肝切除、门静脉分支栓塞和活体肝移植等情况。肝脏生理功能复杂,再生能力强,外科手术预后与肝再生能力密切相关,探索肝再生机制对预防术后发生肝衰和改善预后十分重要。相关研究发现,门静脉高压灌注对于促进肝再生和维护肝功能十分重要。门静脉血流变化似乎是启动和维持肝再生过程、甚至是终止肝再生过程的必要因素。部分肝切除术后,单位组织剩余肝脏得到了更多的血流供应,因为它需要容纳术前分配给已切除肝叶的门静脉血流。在狗部分肝切除术同时实施门腔分流术的实验中,肝再生能力明显下降。近年来,在临床活体肝移植和部分肝切除术的研究中也发现,术后即刻增加的“门静脉血流／肝脏体积比”和门静脉压力增加刺激并调控着肝脏的再生；为预防小肝综合征的发生,如果实施“矫枉过正”的门腔分流,血流灌注量和压力明显下降则导致肝萎缩的发生。人们观察到另外一个现象,肝细胞增殖先后由门静脉周围逐步发生至肝小叶周围区域,中央静脉周围的肝细胞最晚发生增殖；由门静脉至肝静脉的压力梯度中,门静脉周围肝细胞所受应力大于中央静脉周围肝细胞,此现象进一步推测：受应力大的肝细胞增殖反应可能先于受应力小的肝细胞。但血流动力学调节肝再生的具体机制目前仍然未知,可能与门静脉压力引起的相关力学信号通路的激活相关。力学作用下,ECM中的配体与细胞膜整合素受体结合,“ECM-整合素-CSK”信号途径最先被激活,力学信号转导入细胞内并通过下游信号分子调节细胞的生长、增殖。而FAK是该力学信号传导通路的重要组成部分。整合素与ECM相应配体结合后聚集成簇分布,引起FAK的Tyr残基磷酸化,激活FAK,进一步催化胞质中其下游若干信息分子磷酸化,并通过"crosstalk"与生长因子受体通路相联而将细胞信号传入细胞内。在力学信号传导过程中,FAK被认为是力学信号转导的“启动子”。然而,在肝再生过程中,血流力学信号刺激是否引起FAK的表达与活性变化,从而调节肝细胞的增殖尚未见到文献报道。此外,我们已经熟知肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)是促进肝细胞增殖最重要的完全丝裂原物质。HGF与c-Met蛋白结合后,激活受体PTK,使受体自身磷酸化,并使胞浆信使蛋白质磷酸化,同时启动几条信号通路,将增殖信号传至细胞内,通过调节特定基因的表达而促进肝细胞的生长。HGF/c-Met启动的Ras/MAPK信号转导途径被认为是肝细胞生长、增殖最重要的信号通路。遗传性尿激酶缺失大鼠或c-Met缺失大鼠肝再生能力非常差；采用RNA干扰技术“关闭”c-Met,肝细胞增殖周期出现停滞。然而,有学者发现,流体切应力引起肝细胞增殖可能也与这一化学通道相关：流体切应力改变了肝细胞周围的微环境,并将胞外物理／化学信号(HGF...c-Met)转导至胞内,经过系列级联放大反应,表现出增殖等各种效应。Webber等人研究发现,向正常大鼠的门静脉中注入HGF,肝细胞增殖不明显,而向行30%肝切除术的大鼠门静脉中注入HGF,肝细胞明显增殖。由此推测,HGF介导的化学信号途径和流体切应力介导的力学信号途径可能对肝细胞的增殖有协同刺激作用,然而,该假设尚未见到文献报道。本实验针对上述假说展开研究。研究目的本实验分为两个部分,分别探讨在体、离体生物力学(流体力学)对肝再生的影响,以及HGF是否在该过程中有协同作用。(一)动物实验：以SD大鼠为研究对象；制作不同比例肝叶切除模型;于术后不同时间点测量门静脉压力(PVP)值,同时获取肝组织；免疫组化的方法检测肝组织FAK和肝细胞核增殖抗原(PCNA)的表达；探讨门静脉压力变化在大鼠肝再生中的作用以及力学信号因子FAK表达的情况。(二)细胞生物学实验：以永生化大鼠BRL-3A肝细胞株和人HepG2肝癌细胞株为研究对象；制作流体应力加载细胞培养装置；在细胞培养过程中加载不同力值的流体切应力；观察细胞增殖情况并探讨该过程中HGF存在与否的情况下细胞增殖的差异。研究方法(一)PVP对肝再生促进作用及其过程中力学信号关键蛋白FAK表达的研究：1.选取清洁级健康Sprague Dawley(SD)大鼠64只为研究对象；2.建立不同比例(30%、50%、70%)肝切除术模型；3. 实验分组：将大鼠平均分为对照组、30%、50%、70%比例肝叶切除术四组；4. 指标测定和标本获取：分别于术后24 h、48 h、72 h、168 h进行各组实验动物PVP测定,同时获取肝组织标本；5. 免疫组化方法检测各组肝组织细胞核增殖抗原(PCNA)与FAK的表达；6.统计学分析,采用t检验和pearson相关系数检验的方法,探索PVP、PCNA、FAK以及肝组织再生之间的关系。(二)流体切应力与HGF协同作用促进肝细胞增殖的研究：1.研究对象：永生化大鼠BRL-3A肝细胞株和人HepG2肝癌细胞株；2.构建流体切应力加载细胞培养装置：3.实验分组：1)对照组：放入本实验构建的培养加力装置但不加切应力；2)A组(BRL-3A单纯加压组)：对培养的细胞施加不同大小的流体切应力(0,12 dyn/cm2,24 dyn/cm2);3)B组(BRL-3A添加HGF的加压组)：在添加HGF的情况下对细胞施加上述不同大小的力；4)C组(HepG2单纯加压组)：对培养的细胞施加不同大小的流体切应力(0,12 dyn/cm2,24 dyn/cm2);5)D组(HepG2添加HGF的加压组)：在添加HGF的情况下对细胞施加上述不同大小的力。4.采用直接细胞计数和CCK-8 (Cell Counting Kit-8)技术检测不同组别的细胞增殖动力学情况,观察流体切应力是否促进永生化大鼠BRL-3A肝细胞株和人HepG2肝癌细胞株的增殖以及HGF在该过程中是否有协同作用。5.对实验结果进行t检验统计学分析。实验结果(一)PVP对大鼠肝再生促进作用及其过程中力学信号关键蛋白FAK的表达：1.门静脉压力：与对照组比较,各肝叶切除组术后各组门静脉压力均有升高：50%与70%组,术后24 h达到高峰(P<0.01),随后逐渐下降,并在168 h与对照组水平接近(P>0.05);30%切除组24 h门静脉压力略有升高(P<0.05),随后下降至与对照组水平接近(P>0.05)。2.免疫组化检测PCNA:免疫阳性染色呈棕黄色,分布于细胞核内,细胞质略有着色。对照组大鼠肝组织内可见PCNA阳性细胞数少,染色浅淡。按时序观察,各肝叶切除组肝组织术后24h均可见PCNA表达显著增强(数量增多、染色深)(P<0.01)；随后逐渐降低。术后168 h 70%切除组PCNA表达仍高于对照组(P<0.05),其余两组接近对照组或略高于对照组(P>0.05)。按肝叶切除比例观察,在相同时间点,肝切除比例越高,PCNA阳性细胞数量越多,染色越深。3.免疫组化检测FAK:FAK主要表达于细胞质,对照组中可见胞质淡黄色以及少量棕黄色表达,各肝叶切除组术后24 h均可见FAK表达增强(阳性染色细胞数和染色深度增加)(P<0.01)；50%和70%切除组术后24 h和72 h阳性细胞逐渐降低,但仍高于对照组(P<0.05,P<0.01),术后168 h阳性细胞数逐渐下降,接近对照组水平(P>0.05)。30%切除组术后24 h和72h阳性细胞接近或略高于对照组(P>0.05)。相同时间点,肝切除比例越高,FAK阳性细胞数量越多,染色越深。4.相关性分析1)PVP与PCNA相关性：a.70%肝切除组：大鼠PVP在术后24 h、48 h、72 h、168 h和肝再生时间正相关(P<0.05)。b.50%肝切除组：大鼠PVP在术后24 h、48 h、72 h和肝再生时间正相关(P<0.05),术后168 h,PVP与肝再生时间无相关性(P>0.05)。c.30%肝切除组：大鼠PVP在术后24 h、72 h和肝再生时间正相关,(P<0.05),术后48 h、168 hPVP与肝再生时间无相关性(P>0.05)。2) PVP与FAK的相关性：a.70%肝切除组：大鼠PVP在术后24 h、48 h、72 h和剩余肝细胞FAK的表达呈正相关(P<0.05),在术后168 h两者表达无相关性(P>0.05)。b.50%肝切除组：大鼠PVP在术后24 h、48 h、72 h和剩余肝细胞FAK的表达呈正相关(P<0.05),在术后168 h两者表达无相关性(P>0.05)。c.30%肝切除组：大鼠PVP在术后各个时间点表达均无相关性(P>0.05)。3) PCNA与FAK的相关性：a.70%肝切除组：大鼠PCNA在术后24 h、48 h、72 h和剩余肝细胞FAK的表达呈正相关(P<0.05),在术后168 h两者表达无相关性(P>0.05)。b.50%肝切除组：大鼠PCNA在术后24 h、48 h、72 h和剩余肝细胞FAK的表达呈正相关(P<0.05),在术后168 h两者表达无相关性(P>0.05)。c.30%肝切除组：大鼠PCNA在术后48 h和剩余肝细胞FAK的表达呈正相关,其余各个时间点表达均无相关性(P>0.05)。(二)流体切应力与流体切应力/HGF协同作用对永生化大鼠BRL-3A肝细胞株和HepG2肝癌细胞株增殖动力学的影响：1.不同实验条件下永生化大鼠BRL-3A肝细胞株增殖动力学的变化：1)Ao组与Bo组：大鼠永生化BRL-3A细胞株的细胞增殖动力学表现为时间依赖性。 同一时间点,B组增殖明显高于A组(P<0.05)。2)同时间点Ao组和A12组与A24组比较：12 h-72 h间A12组和A24组的细胞增殖明显高于A0(P<0.05),A24组的细胞增殖明显高于A12组(P<0.05)：168 h时,细胞增殖不明显(P>0.05)。3)同时间点Bo组和B12组与B24组比较：12 h-72 h间B12组和B24组的细胞增殖明显高于B0(P<0.05),B24组的细胞增殖明显高于B12组(P<0.05)：168h时,细胞增殖不明显(P>0.05)。4)同时间点A12组与B12组,A24组合B24组比较：12 h-72 h间B12组的细胞增殖明显高于A12组(P<0.05)；B24组的细胞增殖明显高于A24组(P<0.05)；168 h时,细胞增殖不明显(P>0.05)。5)同时间点A12组与A24组,B12组和B24组比较：12 h-72 h间A24组的细胞增殖明显高于A12组(P<0.05)；B24组的细胞增殖明显高于B12组(P<0.05)；168 h时,细胞增殖不明显(P>0.05)；6)施加流体切应力的组细胞均增殖明显,且均在24 h到达增殖高峰,24 h-72 h逐渐下降,但仍高于对照组(P<0.05)：168 h则与对照组水平接近或略高于对照组(P>0.05)。2.不同实验条件下永生化人HepG2肝癌细胞株增殖动力学的变化趋势与永生化大鼠BRL-3A肝细胞株增殖动力学的变化趋势一致。全文结论(一)动物实验结果显示：肝叶切除比例越大,PVP值升高越明显；与之相应,肝组织PCNA和FAK的表达亦越明显,且一致表现为24小时达到高峰值。随着手术后时间的延长,在大鼠肝脏体积增长接近正常大小的时候,各组PVP、PCNA和FAK的变化逐渐趋于一致。统计学相关性分析结果提示肝叶切除比例的大小、PVP值的变化和PCNA、FAK的表达呈现一致性。说明门静脉血流力学的变化和FAK介导的力学信号传导因素在肝再生过程中发挥了至关重要的调节作用。(二)流体切应力对永生化大鼠BRL-3A肝细胞株和人HepG2肝癌细胞株的增殖有促进作用,在生理可承受范围内,流体切应力越大,细胞增殖越明显；在相同应力大小作用下,添加HGF的细胞增殖高于未添加HGF的细胞。说明在肝细胞增殖的过程中,力学因素和化学因素二者具有协同的作用。