阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)又称老年痴呆症,是以德国精神病学家Alois Alzheimer名字命名的一种老年神经变性综合症。该病以记忆逐步减退和进行性认知障碍为临床特征。年龄是AD的重要危险因素。由于人均寿命延长,老年人口迅速增长,AD患病人数必然相应增加。我国65岁以上老人中AD患病率为0.3‰左右,已与发达国家接近。AD自1906年发现至今已有百多年历史,迄今仍未有有效治疗方法。该病不仅造成老年人群生活质量下降,同时也给社会和家庭带来沉重的经济和心理负担,成为老龄社会中主要卫生保健和社会问题。所以寻找有切实有效的治疗药物一直是AD研究领域的重要课题。据目前细胞学和分子生物学的研究普遍认为,以β-淀粉样蛋白(p-amyloid protein, Aβ)为主要成分的神经元缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑(senile plaques, SP)形成是引起脑内胆碱能神经元的功能障碍和死亡的主要原因。Aβ与小胶质细胞表面的清道夫受体或糖基化终产物受体结合,激活小胶质细胞,导致炎性因子的释放。这些炎性因子如：IL-1、TNF-αIL-6等造成神经元的功能和行为障碍。最近的证据表明,炎性介质会通过上调β-分泌酶刺激淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的加工过程并形成一个恶性循环,使病情不断进展。有多篇文献阐明,非甾体类抗炎药可以降低患AD的危险性并延缓发病,由此可以推断：慢性炎症过程是AD病理过程中的重要机制,抗炎是治疗AD的切实可行的措施。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF),是由174个氨基酸组成的多肽和4%葡萄糖苷型糖链组成的糖蛋白。主要在中性粒细胞及神经细胞和胶质细胞表达。它的主要作用有：1促增殖与分化,2抗炎,3抗凋亡。最近的研究证实,G-CSF具有神经保护的作用,作用机理主要是通过减少致炎因子的释放,而发挥神经保护作用。TNF和IL-1p是炎症中的主要调节因子,G-CSF主要通过对两者的抑制作用发挥它的抗炎作用,其机制不明。烟碱型胆碱能受体(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)是配体门控性离子通道,由五个亚单位构成。α7nAChR是脊椎动物脑中分布最广的两类nAchR亚型之一,在神经突触传递过程中其重要作用。近年来研究发现,a7nAChR表达增高能够降低致炎因子的分泌,是胆碱能抗炎通路的关键受体。a7nAChR的表达增高能够改善AD患者的认知能力。根据已往的研究发现,G-CSF可能通过抑制炎症治疗AD。作为最新的治疗AD的策略,本研究将G-CSF应用于APPV717I转基因AD模型小鼠,以探讨G-CSF的抗炎作用和可能的抗炎机制,为今后对AD的治疗提供理论依据和事实依据。本研究共分四部分进行。第一部分G-CSF对阿尔茨海默病小鼠的认知功能的影响目的对G-CSF治疗前后老年痴呆症模型小鼠和野生小鼠进行生物行为学研究,通过水迷宫测试对老年痴呆症模型小鼠和野生小鼠的学习记忆功能进行观察,探讨G-CSF对老年痴呆症模型小鼠和野生小鼠的认知功能的影响。方法1.10月龄APP V717转基因老年痴呆模型小鼠和10月龄野生小鼠,分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。对照组连续7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution；磷酸盐缓冲液)；G-CSF治疗组连续7天皮下注射G-CSF;野生组连续7天皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数,三组小鼠又分为三个亚组：7天组、14天组、28天组。2.各组小鼠于注射前后分别进行水迷宫定位航行试验。3.取个时间点小鼠脑组织制作病理切片,用HE (haematoxylin&eosin)和Nissl染色进行形态学观察。4.利用统计软件对G-CSF治疗前后的老年痴呆模型小鼠和野生型老龄小鼠的水迷宫实验数据进行统计分析。观察G-CSF对老年痴呆模型小鼠的认知的影响。结果1.各组小鼠Morris水迷宫测试结果：AD模型组逃避潜伏期和游泳距离较野生组明显延长(P<0.01),G-CSF治疗组显著缩短潜伏期和游泳距离,和野生组水平相当。同组大鼠,随着训练时段的增加,G-CSF治疗组的潜伏期和游泳距离越来越短(P<0.01)。各组小鼠游泳速度没有明显差异。可以排除因个体差异引起的不同。2.HE及Nissl染色示野生小鼠海马神经元结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。AD模型组可观察到小鼠海马神经元损伤,表现为神经元肿胀、破裂,排列紊乱,胞浆内尼氏小体减少,存活神经元数目较对照组减少(P<0.05)。G-CSF治疗组海马神经元结构与野生组相似。结论1.阿尔茨海默病小鼠认知功能减退。2. G-CSF治疗后阿尔茨海默病小鼠认知功能改善。3. G-CSF治疗对阿尔茨海默病小鼠海马神经元有保护作用。第二部分G-CSF对阿尔茨海默病小鼠脑内炎症的影响目的研究G-CSF对APPV717I转基因阿尔茨海默病小鼠脑内炎症的影响。方法1.10月龄APP V717转基因老年痴呆模型小鼠和10月龄野生小鼠,分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。对照组连续7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸盐缓冲液)；G-CSF治疗组连续7天皮下注射G-CSF;野生组连续7天皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数,三组小鼠又分为三个亚组：7天组、14天组、28天组。2.小鼠分别在各时间点灌注多聚甲醛后取脑,免疫荧光的方法检测小鼠大脑皮层细胞的IL-1β. TNF-a表达变化及G-CSF对其表达的影响。结果1.图像分析结果显示,AD模型7天组、AD模型14天组、AD模型28天组的IL-1β光密度值均高于同一天的G-CSF治疗组和野生组,且有统计学意义(P<0.01或0.05)；三组比较有显著性差异(P<0.05)。2.图像分析结果显示,AD模型14天组、AD模型28天组的TNF-a光密度值均高于同一天的G-CSF治疗组和野生组,且有统计学意义(P<0.01或0.05)；三组比较有显著性差异(P<0.05)。结论1.阿尔茨海默病模型小鼠脑内炎症因子IL-1β和TNF-a含量相对于野生型同龄小鼠有明显升高。2. G-CSF治疗,可以降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内炎症因子IL-1β和TNF-a含量。3.推测阿尔茨海默病模型小鼠脑内可能伴随炎症反应,这一反应参与了老年痴呆模型小鼠脑内神经元的损伤过程。而G-CSF彳很可能通过抑制阿尔茨海默病模型小鼠的脑内炎性因子IL-1β、TNF-a的表达而抑制脑内的神经炎症反应,对阿尔茨海默病模型小鼠的大脑皮层神经元起一定的保护作用。第三部分G-CSF对阿尔茨海默病小鼠脑内的乙酰胆碱受体α7表达的影响目的研究G-CSF对阿尔茨海默病小鼠脑内的a7nAChR的表达水平的影响,探讨a7nAChR在胆碱能通路中的关键地位。方法1.10月龄APP V717转基因老年痴呆模型小鼠和10月龄野生小鼠,分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。对照组连续7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution;磷酸盐缓冲液)；G-CSF治疗组连续7天皮下注射G-CSF;野生组连续7天皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数,三组小鼠又分为三个亚组：7天组、14天组、28天组。2.各组小鼠分别在各时间点灌注多聚甲醛后取脑,制作冰冻切片。用免疫组化染色的方法检测小鼠大脑皮层细胞α7nAChR的蛋白表达水平变化及G-CSF对其表达的影响。2.将各组小鼠分别在各时间点断头取脑,脑组织-80℃存储待用。3.应用Western blotting方法检测各亚组小鼠大脑α7nAChR的蛋白表达水平。结果(1)图像分析结果显示,G-CSF治疗7天组、G-CSF治疗14天组、G-CSF治疗28天组的α7nAChR光密度值均高于同一天的AD模型组和野生组,且有统计学意义(P<0.01或0.05)；三组比较有显著性差异(P<0.05)。(2)α7nAChR蛋白表达比较：G-CSF治疗7天组、G-CSF治疗14天组、G-CSF治疗28天组的α7nAChR蛋白表达均高于同一天的AD模型组和野生组,且有统计学意义(P<0.01),同一天AD模型组α7nAChR蛋白的表达较野生组明显降低(P<0.01)；三组比较有显著性差异(P<0.05)。结论1.α7nAChR在各亚组小鼠大脑皮层细胞普遍表达。2.阿尔茨海默病小鼠大脑皮层细胞α7nAChR的蛋白表达水平明显降低。3.应用G-CSF能够明显增加各亚组小鼠大脑皮层细胞α7nAChR的蛋白表达水平,对阿尔茨海默病小鼠具有神经保护功能。第四部分G-CSF对NF-kB的表达的影响及炎症机制的研究目的研究G-CSF对阿尔茨海默病小鼠脑内的NF-kB的表达水平的影响以及NF-kB表达水平与α7nAChR表达的关系,探讨α7nAChR在胆碱能通路中的关键地位。方法1.10月龄APP V717转基因老年痴呆模型小鼠和10月龄野生小鼠,分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。对照组连续7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸盐缓冲液)；G-CSF治疗组连续7天皮下注射G-CSF;野生组连续7天皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数,三组小鼠又分为三个亚组：7天组、14天组、28天组。2.小鼠分别在各时间点灌注多聚甲醛后取脑,免疫荧光的方法检测小鼠大脑皮层细胞的NF-kB表达变化及G-CSF对其表达的影响。3.用统计学的方法对小鼠大脑皮层细胞的NF-kB表达变化和a7nAChR表达变化进行相关性分析。结果相关性分析显示G-CSF治疗后AD模型小鼠7天组、14天组、28天组脑内NF-kB和α7nAChR表达成负相关(7天组：r=-0.73,p=0.007；14天组：r=-0.83,p=0.008；28天组：r=-0.89,p=0.02,)。结论G-CSF治疗后AD模型小鼠脑内NF-kB的表达水平与α7nAChR的表达水平成负相关,说明G-CSF治疗的抗炎机制是通过增加a7nAChR的表达,降低了NF-kB表达,从而减少致炎因子的转录。