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胚胎干细胞和诱导多能干细胞统称为多能干细胞。胚胎干细胞是来源于哺乳动物囊胚期内细胞团的一群高度未分化的细胞,诱导多能干细胞是通过将外源转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc导入体细胞后重编程形成的干细胞。多能干细胞具有自我更新和分化潜能,适当条件下可分化成多种细胞及组织,在再生医学领域具有广阔的前景。 目前对胚胎干细胞自我更新调控机制的研究主要集中在胞外信号、转录调控与表观遗传修饰等方面。LIF、BMP4及WNT等因子与膜表面受体结合后,进而通过级联反应促进多能性转录因子表达并抑制分化基因活性维持干细胞自我更新。Nanog、Oct4和Sox2构成核心转录环路,协同促进多能性基因表达并抑制分化基因表达;组蛋白乙酰化、DNA甲基化或RNA甲基化等对多能性的维持不可或缺;非编码RNA如miRNA和lncRNA可靶向多种转录因子调控多能性。 蛋白激酶在细胞信号识别与转导中具有关键作用,然而目前蛋白激酶对多能干细胞命运调控机制尚不清楚。有研究表明胚胎干细胞中大多数蛋白激酶表达水平较低而且多处于抑制状态,如抑制激酶Mek和GSK3对维持胚胎干细胞Na(i)ve状态是必不可少的。但本研究通过比较705种激酶在小鼠多能干细胞和分化的体细胞中表达水平,发现蛋白激酶PIM2在多能干细胞中高表达。PIM2是组成型激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有调控细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢及蛋白翻译等多种生物学功能。PIM2在多种肿瘤细胞及造血系统中高表达,对肿瘤生长及造血干细胞自我更新具有重要作用。但PIM2对多能干细胞命运的调控尚未有报道。本研究探索蛋白激酶PIM2对小鼠胚胎干细胞多能性及对体细胞重编程的调控。 本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在胚胎干细胞中敲除Pim2基因。实验结果发现,敲除Pim2后胚胎干细胞克隆形成率降低,Nanog、Oct4及Sox2等多能性基因表达下降,胚胎干细胞的中胚层分化潜能下降,以及畸胎瘤体积减小且重量降低。表明PIM2的缺失导致胚胎干细胞自我更新和分化潜能的障碍。 敲除Pim2不影响胚胎干细胞增殖和凋亡,表明PIM2并不通过细胞增殖或凋亡调控胚胎干细胞自我更新。进一步研究发现,敲除Pim2降低4E-BP1磷酸化水平,暗示PIM2可能通过磷酸化4E-BP1调控胚胎干细胞多能性。为验证这一假说,我们在敲除Pim2的胚胎干细胞中分别过表达4e-bp1或4e-bp1激活形式(4e-bp1-D)。结果发现,在Pim2敲除的胚胎干细胞中过表达4e-bp1激活形式,可以挽救敲除Pim2后胚胎干细胞克隆形成率的降低以及恢复多能性基因表达水平及畸胎瘤形成能力。而且,向胚胎干细胞培养基中分别加入10和20μM的eIF4E抑制剂ribavirin会显著抑制胚胎干细胞的克隆形成率和多能性基因表达水平,但不影响胚胎干细胞增殖和凋亡水平。 综上所述,胚胎干细胞中高表达的PIM2通过磷酸化4E-BP1释放翻译起始因子eIF4E,促进eIF4E与eIF4G、eIF4A翻译起始复合体的形成,从而增强Oct4、Sox2及Nanog等多能性基因的翻译水平,进而维持了胚胎干细胞的多能性 此外,在体细胞重编程为诱导多能干细胞的过程中,Pim2表达水平逐步增加。干扰Pim2表达会显著降低体细胞重编程效率,而过表达Pim2可以提高体细胞重编程效率。