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目的白藜芦醇被证实具有延长寿命、抗氧化、抗衰老、抗炎症等心血管保护作用,但其抗炎机制尚未完全清楚,近年研究证实CD40与其配体CD40L相互作用在动脉粥样硬化炎症反应中扮演着非常重要的角色,本研究旨在通过细胞及动物实验,模拟人体动脉粥样硬化模型,研究CD40/CD40L信号轴对血管内皮炎性损伤和动脉粥样硬化的影响及机制,阐明白藜芦醇通过SIRT1激活,调控CD40/CD40L信号通路抑制血管炎症反应及抗动脉硬化的可能分子机制,发掘白藜芦醇重要的生物学意义和临床使用价值。方法:1.白藜芦醇对HUVECs增殖活力及炎症环境下释放的炎症因子、趋化因子和活性氧的影响,不同浓度TNF-α和白藜芦醇作用于HUVECs,观察细胞的增殖活力,ELISA法检测细胞上清液的炎症因子IL-6,趋化因子MCP-1的水平,流式细胞法检测活性氧的水平。2.观察SIRT1在白藜芦醇作用下HUVEC内的表达定位,细胞免疫荧光染色法检测在白藜芦醇、SIRT1小干扰RNA作用下SIRT1在TNF-α刺激的HUVECs内细胞质和细胞核内的表达定位。3.筛选白藜芦醇干预TNF-α刺激的HUVECs后的差异表达基因,检测SIRT1和CD40表达水平改变,全基因组表达谱芯片筛选白藜芦醇干预TNF-α刺激的HUVECs后的差异表达基因。采用RT-PCR和WB法,观察一定TNF-α浓度诱导后,内皮细胞在白藜芦醇作用下SIRT1、CD40、NF-κB、p38 MAPK的转录水平和蛋白水平表达变化。4.采用免疫共沉淀法观察SIRT1蛋白与NF-κB蛋白的结合情况,采用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB结合对CD40启动子区的转录活性的调节。通过p38MAPK的抑制剂SB203580干预观察p38 MAPK对NF-κB的活性的影响。5.高脂喂养LDLR-/-转基因小鼠,构建动脉粥样硬化模型,观察白藜芦醇对动脉粥样硬化小鼠的脂质代谢及斑块大小的影响,将LDLR-/-小鼠分四组,分别为普通饲料组,高脂饮食加丙二醇溶剂组,高脂饮食组,高脂饮食加白藜芦醇干预组。检测血脂水平,HE染色及病理组化检测斑块大小及CD40表达。结果:1.白藜芦醇保护内皮细胞的增殖活力抑制炎性反应下释放的炎症因子、趋化因子和活性氧:CCK-8结果显示10μg/L TNF-α对HUVECs的细胞活力产生抑制作用,在10-20μmol/L的浓度范围内白藜芦醇预处理HUVECs可保护损伤的细胞活力,并且呈浓度依赖性。TNF-α促进HUVECs炎症因子IL-6、趋化因子MCP-1的释放,增加胞内活性氧的产生。白藜芦醇抑制上述炎症因子及趋化因子的释放,抑制活性氧的产生,抑制单核细胞的迁移活动。2.SIRT1在细胞胞质与胞核内均有表达,白藜芦醇活化SIRT1促进SIRT1从细胞质转向细胞核调节下游信号分子。3.白藜芦醇促进TNF-α刺激的HUCECs的SIRT1转录及蛋白水平的表达,抑制CD40、NF-κB的表达水平的改变,抑制p38 MAPK的磷酸化。4.白藜芦醇可以通过SIRT1活化抑制NF-κB的活性并抑制p38 MAPK的磷酸化水平。白藜芦醇可能通过抑制NF-κB与CD40启动子的结合抑制CD40的转录水平。5.白藜芦醇控制高脂喂养LDLR-/-转基因小鼠体重,调节动脉粥样硬化小鼠血浆中总甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平,升高动脉粥样硬化小鼠血浆中高密度脂蛋白胆固醇的水平。白藜芦醇减少脂质斑块的产生,减小脂质斑块的面积,抑制内膜增生,降低CD40表达水平。结论:1.白藜芦醇抑制TNF-α刺激脐静脉内皮细胞上清液IL-6和MCP-1的水平并调节SIRT1、CD40、p38 MAPK和NF-κB的表达,提示其抗炎症的分子机制可能为:白藜芦醇激活SIRT1抑制它的下游信号分子p38 MAPK和NF-κB的活性,进而抑制CD40的转录及蛋白表达水平,使炎性细胞因子及趋化因子减少,单核巨噬细胞迁移减少。2.高脂饮食喂养成功建立了LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化模型;白藜芦醇可有效降低血脂水平,改善LDLR-/-模型小鼠的动脉粥样硬化炎症及斑块稳定性,其机制与部分抑制CD40的表达有关,为CD40作为白藜芦醇治疗动脉粥样硬化的重要靶点奠定基础。