热休克能引起许多与DNA半保留复制相关的细胞核功能的变化，包括了新的复制的起始，DNA在复制叉处的延长，新的组蛋白进入染色质过程中的合成和沉积，新合成DNA形成染色体的识别。热休克，尤其当其温度超过42℃时能引起细胞死亡，但是这其中的分子机制还不十分清楚。尽管有文献报道DNA损伤有可能参与了热休克杀伤细胞的过程，也有研究发现热休克并不能诱导DNA的损伤。所以进一步研究热休克导致细胞死亡的机制中是否有DNA损伤的参与是非常有必要的。单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)是一种在环境中广泛存在的化学诱变剂和致癌剂。它是一种N-亚硝基化合物，属于可直接与DNA作用的遗传毒物，通过直接靶定DNA而诱发细胞产生遗传毒性应激，并导致染色体异常、姐妹染色单体改变、点突变以及细胞死亡，是化学致癌物诱变机理研究中常用的一种模式化合物。此外，研究者们应用彗星实验发现MNNG能诱导细胞DNA双链断裂的形成。近年来研究发现，DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)出现后，组蛋白家族成员H2AX C-端139位丝氨酸残基(Ser)可被磷脂酰肌醇3—激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)样家族成员磷酸化形成γH2AX(gamma-H2AX)。γH2AX可以募集其它DNA修复蛋白到损伤位点，形成焦点(foci)结构，共同完成DNA修复过程。在电离辐射(ionizing radiation，IR)后，在损伤位点快速形成γH2AX焦点，并且焦点的数量与IR造成的DSBs的数量存在一一对应关系，表明γH2AX焦点的形成可用于检测IR诱导的DSBs。另外发现，其它间接导致DSBs的遗传毒物如顺铂、喜树碱也诱导γH2AX焦点的形成。因此，直接或者间接导致的DSBs的产生都能诱导γH2AX焦点的形成。γH2AX焦点与DSBs之间的密切关系表明γH2AX极有可能成为检测细胞DNA损伤特别是DSBs的一个新的特异性指标。鉴于以上原因，为了进一步研究热休克能否引起细胞的遗传毒性，我们用γH2AX作为DNA损伤的指标，对热休克的遗传毒性进行了系统研究。热休克可降低细胞的生存率热休克(45℃，30min)处理CHL、HeLa细胞后，间隔不同时间，用MTT法检测细胞的存活率。结果发现：热休克45℃，30min可使CHL、HeLa细胞的存活率下降。将细胞放置于37℃继续孵育并不能逆转热休克后生存率下降的趋势，在热休克后0.5、2、8和24 h，CHL、HeLa细胞的存活率与未经热休克处理的对照组相比也是降低的，并且随着时间的延长与对照组相比细胞的相对生存率降低。免疫荧光实验证明热休克不能在HeLa或CHL细胞中诱导γH2AX焦点的形成HeLa或CHL细胞在45℃热休克30min后继续在37℃孵育0、0.5、2和8 h后，与空白对照组相比CHL细胞中γH2AX焦点的数量无明显变化，仍然是多数细胞无γH2AX焦点的存在，少部分细胞中含有1-10或更多的焦点。这表明热休克不能诱导γH2AX焦点的形成。热休克不能在p53缺失细胞中诱导γH2AX焦点形成p53在维持细胞基因组的稳定性中发挥着重要作用，因此我们进一步探讨p53的缺失可否影响γH2AX焦点的形成。为此我们采用了U2OSE6tet24细胞。此种细胞在培养基中有四环素存在的情况下，p53有正常的表达，在缺乏四环素的时候则无p53的表达。我们发现，在p53缺失的情况下热休克处理后γH2AX焦点的数目并没有增多，表明热休克不能在p53缺失的细胞中诱导γH2AX焦点的形成。热休克不能在FEN1缺失细胞中诱导γH2AX焦点的形成FEN1在DNA复制和修复中起了非常重要的作用，我们发现FEN1的缺失可以导致基因组不稳定，并且能够增强MNNG的细胞毒性反应，因此我们选用此种细胞来进一步检测FEN1的缺失是否会影响由热休克所引起的细胞的γH2AX焦点形成。结果发现，在FEN1缺失细胞中，热休克处理后γH2AX的数目较之空白对照组没有增多。表明热休克不能诱导FEN1缺失细胞产生γH2AX焦点。热休克预处理可抑制MNNG诱导的γH2AX焦点的形成为了进一步研究热休克与其他药物协同作用后对细胞γH2AX焦点形成的影响，我们观察了热休克预处理后MNNG诱导细胞γH2AX焦点的情况。1μg／mlMNNG在FL、CHL细胞中作用2 h能强烈诱导γH2AX焦点的形成。然而，当FL、CHL细胞在45℃热休克30 min后再进行1μg／ml MNNG处理2 h，用免疫荧光和流式细胞仪检测的到的结果都显示γH2AX焦点数目与荧光强度都较之单纯MNNG处理组降低。热休克后处理不影响MNNG诱导的γH2AX焦点的形成因为热休克预处理可影响MNNG诱导的γH2AX焦点的形成，所以我们进一步探讨对于已经被MNNG诱导产生的γH2AX焦点，热休克是否也能够使其数目减少或者荧光度降低。实验结果显示在MNNG诱导产生γH2AX焦点后再进行热休克(45℃，30 min)，通过免疫荧光和流式细胞仪对γH2AX焦点进行检测，其数目和荧光强度并没有减少或者降低。结论：第一，热休克后细胞的生存率降低，说明热休克具有细胞毒性。第二，热休克后在CHL、HeLa细胞中用免疫荧光及流式细胞仪都检测不到γH2AX的增多，并且在p53缺失以及FEN1缺失的细胞中也是如此，说明热休克不能诱导CHL、HeLa产生γH2AX，p53和FEN1也并不参与热休克影响细胞产生γH2AX的过程。第三，热休克预处理减少了MNNG诱导的γH2AX焦点的形成，说明热休克可影响MNNG诱导细胞产生γH2AX焦点的形成过程。第四，热休克处理不能使已经由MNNG诱导产生的γH2AX焦点数目减少，说明热休克不能影响已经由MNNG诱导产生的γH2AX焦点。