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冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使血管腔阻塞,导致心肌缺血,缺氧而引起的心脏病,简称冠心病(CHD)。 CHD是一种严重危害人类健康的常见病,多发病。在欧美等发达国家,其死亡率占各类疾病死亡率的首位。据统计,我国CHD的平均患病率为6.49%,近年来CHD的发病率和病死率呈快速攀升趋势,极大的威胁人类健康,并给社会及家庭带来了沉重的经济负担。我国疾病监测系统资料显示,90年代以来CHD死亡率一直呈现上升趋势,1991年死亡率为25.3/10万,到1998年已经上升到42.7/10万,7年间上升了50%左右,目前全世界心肌梗塞的死亡率已仅次于癌症而位居第二。因此,如何有效地防治CHD已成为当今世界范围内的一项重要科研课题。本实验将在第一部分从整体的角度观察冠心平对动脉粥样硬化金黄地鼠血管功能的调节,在第二部分从体外细胞分子角度观察冠心平保护血管内皮细胞和抗细胞凋亡的作用。第一部分冠心平对动脉粥样硬化金黄地鼠的影响采用94%基础饲料、1%胆固醇、5%猪油配制的高脂饲料喂养金黄地鼠,通过定期的血液指标检测和病理指标检测,建立动脉粥样硬化金黄地鼠模型。再连续给予冠心平6周,6周后取血检测及肝脏、主动脉病理观察。第一节中选取一般指标分析模型建立情况,分别从体重,血脂,主动脉病理和肝组织病理方面考察冠心平作用,结果显示冠心平可降低高脂饲料喂养后金黄地鼠的体重,同时对于血脂中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白水平有调节作用。对高脂饲料造成的肝脏及主动脉损伤有明显改善作用。第二节以动脉粥样硬化金黄地鼠外周血中激素水平为研究对象,结果显示冠心平调节高脂饲料喂养后金黄地鼠的氧化应激水平,降低外周血清的MDA水平,同时升高SOD水平；冠心平对高脂饲料喂养后金黄地鼠的促凝与纤溶系统有调节作用,升高外周血中t-PA水平,降低PAI的水平；冠心平对高脂饲料喂养后金黄地鼠的血小板凝聚功能亦有调节作用,降低外周血中TXB2水平,升高6-Keto-PGF1α水平,减小了TXB2/6-Keto-PGF1α的比值；此外,冠心平还降低高脂饲料喂养后金黄地鼠外周血中TNF-α水平,升高了NO水平,发挥炎症因子调节作用。第三节采用免疫组织化学方法,考察冠心平对动脉粥样硬化金黄地鼠主动脉中ICAM-1、 TNF-α、 NF-κB及IL-10的影响,同时考察对于主动脉凋亡程度的影响。结果显示,冠心平可降低高脂饲料喂养后金黄地鼠主动脉组织中ICAM-1、 TNF-α、 NF-κB的表达水平,对IL-10的表达影响不明显。同时抗金黄地鼠主动脉组织的凋亡,具有保护主动脉结构的作用。第二部分冠心平干预血管内皮细胞损伤的机理研究本章中采用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,运用血清药理学方法制备兔含药血清,以含药血清与血管内皮细胞共培养,再以H202诱导细胞损伤,采用一系列生化、分子生物技术考察冠心平对于构成血管内膜重要组成部分的血管内皮细胞在氧化损伤下的影响。第一节筛选H202合适的损伤浓度。体外培养HUVEC细胞,将H202用不含血清的RPMi1640配制成不同的浓度梯度,与HUVEC共培养24h,以MTT法检测不同浓度下H202对HUVEC的损伤程度,以考察出合适的造模浓度。结果显示,不同浓度的H202与HUVEC共培养后,发现H202浓度在50-100umol/L时,对HUVEC损伤较为合适。第二节考察在冠心平含药血清干预下,血管内皮细胞在H202诱导损伤后,细胞培养液上清中氧化应激水平与影响内皮细胞功能因子的变化情况,结果显示含药血清与HUVEC共培养后,再加入H2O2共培养24h,冠心平含药血清可以调节氧化应激反应,降低细胞培养液上清中MDA水平,并且升高SOD水平,同时,还可以降低培养液上清中ET水平,升高NOS水平。第三节利用酶联免疫反应考察在冠心平含药血清干预下,血管内皮细胞在H202诱导损伤后,细胞培养液上清中炎性因子水平的变化情况,结果显示冠心平含药血清与HUVEC共培养后,再加入H2O2共培养24h,冠心平含药血清可以调节炎症因子的分泌,降低细胞培养液上清中IL-1、IL-6和TNF-α水平,减少炎症因子水平。第四节体外培养HUVEC细胞,采用血清药理学制备含药血清,与细胞共培养,将H202的不含血清的RPMI1640培养液配制为100umol/L浓度,与HUVEC共培养12h,以流式细胞仪法和Hoechst33258荧光染色法检测冠心平含药血清对H202诱导HUVEC凋亡的影响。结果显示含药血清与HUVEC共培养后,再加入H2O2共培养12h,流式细胞仪法结果冠心平含药血清可以减少细胞的凋亡率；Hoechst33258荧光染色法结果显示冠心平药物干预后,细胞凋亡过程中细胞核染色质出现的固缩状态明显改善。第五节考察冠心平对H2O2诱导的HUVEC损伤模型凋亡过程重要蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3的影响,采用免疫组化的方法,原位染色。结果显示含药血清与HUVEC共培养后,再加入H2O2共培养12h,免疫组织化学法结果冠心平含药血清可以减少细胞的凋亡过程中Bax和Caspase-3蛋白的表达,升高Bcl-2的表达。显示了冠心平具有H2O2诱导的HUVEC的抗凋亡作用,可能是通过其调节凋亡进程中重要的凋亡蛋白Bax、 Bcl-2及Caspase-3途径实现的。