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本论文以假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SM9913所产适冷蛋白酶MCP-01为研究对象,研究包括氨基酸序列分析、酶的自溶机制以及化学修饰对酶结构和功能的影响。
通过对MCP-01氨基酸序列的比对,发现MCP-01与protease K subfamilv中的两条序列同源性最高(42%),且含有该subfamily的保守序列,因此将MCP-01归于此subfamily。氨基酸组成的研究中,发现MCP-01的催化结构域和整个成熟酶都含有适冷酶的普遍特征:较高的酸性氨基酸、Gly含量,较低的碱性氨基酸、Pro、Arg含量、A-index值。分别以1DBI和1R64(PDB编号)为模版,对催化结构域和PKD结构域进行了三维模型构建:催化结构域的三维结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,存在一个有α-螺旋和β-折叠围成的催化腔,参与催化的Ser、Asp、His存在于催化腔的底部;PKD结构域则主要由β-折叠,几乎不含α-螺旋和其他二级结构。
在MCP-01自溶机制的研究中,我们探索了高T值SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE体系对MCP-01自溶片断的分辨能力。同时通过sigmascan对0.2mg/ml的MCP-01在35℃、50mM pH 7.5的tris-HCI缓冲体系中自溶速度的分析,判断MCP-01酶分子的降解是一级反应,说明酶分子与自溶片断之间没有相互降解作用。然后通过对自溶条带N端序列的测定,得到M1-M4的N端和MCP-01的完全同,说明该酶的自溶是从C端开始的;通过分析M5-M8的N端序列,得到4个自溶位点,全部位于催化结构域:Thr38位于S8结构域的N端,Ala63、A1a91、Ala203位于无规则蜷曲区域中。
采用还原胺化、高碘酸盐氧化、戊二醛交联、EDC交联的方法,主要选取部分单糖和二糖为修饰试剂,对产物酶的热稳定性进行测定,发现0.1%戊二醛处理产物的稳定性略高于对照。于是选取戊二醛.葡糖胺的方法对MCP-01进行修饰,对修饰酶和对照的最适酶活温度、酶促反应动力学、热失活动力学、紫外吸收光谱、内源荧光光谱、Far-UV CD光谱、热变性动力学进行了分析。修饰酶的热失活半衰期t<,1/2>、热变性熔化温度T<,m>、变构自由能AG<[#]>都高于对照,反映出戊二醛-葡糖胺修饰酶的热稳定性有一定幅度的提高。根据热变性的AH<,m>(修饰酶>对照)以及CD光谱的θ<,222nm(修饰酶<对照),推断热稳定性的提高丰要来自修饰酶α-螺旋含量的提高。另一方面,从酶促反应活化熵ΔS(修饰酶<对照)、热变性vant hoff熵ASm(修饰酶>对照)、紫外吸收光谱(修饰酶的增色和红移效应)、内源荧光光谱(修饰酶的减色和红移效应)来看,修饰酶的松散度(flexibility)也得到了提高,且松散度提高是修饰酶转换数(1<,cat>)得到提高的主要原因。但是,酶促反应动力学表明修饰酶的催化效率低于对照,主要原因是修饰酶的底物亲和力l/Km下降。