创伤愈合（wound healing）是指机体遭受外力的作用,使组织出现离断或缺损时,由周围组织细胞再生和纤维性修复的过程。在创伤修复的过程中,常见有瘢痕形成不足,导致创面开裂或者形成慢性溃疡,亦见于感觉丧失区,如糖尿病性周围神经病变可伴有神经源性溃疡等异常情况发生。血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor,PDGF）作为一种血清生长因子,能够刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等多种细胞的迁移和增殖,在组织修复的纤维化过程,PDGF能够促进细胞外基质成分如胶原、透明质酸等的合成、分泌。PDGF家族包括PDGF-A/-B/-C/-D四种单体,PDGF单体无活性,需要两种相关单体通过二硫键连接形成二聚体。PDGF-BB在临床上常用于促进创面愈合,如慢性糖尿病足的愈合等。MMP-9为基质金属蛋白酶家族中的一种,又称为明胶酶B,主要参与急性创面修复的几个早期过程,包括角质形成细胞从基底膜脱离,促进细胞沿创面基质爬行、纤维蛋白.纤维连接蛋白基质的再塑形等。目前,PDGF-BB应用于创面治疗已显示出独特的效果,但与化学药和传统医药相比,基因工程制药因其生产和应用时间较短,许多与生长因子相关的药理与毒理问题尚未完全解决。而中药在炎症、免疫性疾病中的应用具有悠久历史。由于中药毒副作用小,资源丰富,因此,寻找开发具有促进创面愈合活性的中药新药具有重要的意义。丹皮酚（Paeonol,Pae）,是毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa和萝摩科植物徐长卿Nanchum paniculatum.的主要活性成分,具有良好的抗炎、抗变态反应、免疫调节等作用。对于PDGF-BB促进创面愈合的机理,目前已有的研究多局限于PDGF-BB对成纤维细胞增殖的促进作用。本研究结合了PDGFR-β、PDGF-BB以及调节创面愈合进程的另一关键因素——MMP-9,分别从受体表达改变,ECM降解,炎症因子分泌三个角度对PDGF-BB促进创面愈合的机理进行了研究。有研究表明,人皮肤创面在进行愈合时,TNF-α的过高表达会抑制愈合进展,导致创面不愈。因此,本研究以TNF-α刺激人真皮成纤维细胞,模拟皮肤创面难愈时的内环境。考察了PDGFR-β,MMP-9在创面难愈内环境下的表达变化。随后应用PDGF-BB与TNF-α共孵育,考察了PDGF-BB对创面难愈内环境下MMP-9的表达调控情况。最后,使用PDGF-BB干预人真皮成纤维细胞,考察PDGF-BB对细胞炎症因子分泌的影响。本研究还同时探讨了丹皮酚对上述各指标的调节作用。通过本课题的研究,有助于进一步阐明PDGF-BB及其受体PDGFR-β在创面愈合中的作用和调控机制,以及是否通过MMP-9这一靶点促进创面愈合,为PDGF-BB促进创面愈合提出可能的机制。同时,还探讨了中药丹皮酚对这些靶点的调控作用,为寻找促进创面愈合的药物提供的了新的思路。第一部分PDGF-β受体在人真皮成纤维细胞中的表达及药物作用研究1.建立了人真皮成纤维细胞原代培养方法,用MTT法考察了丹皮酚对人真皮成纤维细胞生存性的影响。2.RT-PCR法证实,在人真皮成纤维细胞中存在PDGFR-βmRNA表达,10μg·L^-1TNF-α可显著上调PDGFR-βmRNA的表达,丹皮酚能抑制TNF-α引起的PDGFR-βmRNA表达上调,且存在良好的剂量关系。3.流式细胞术结果证实,在人真皮成纤维细胞膜表面存在PDGFR-β表达,基础阳性表达率为28.65±0.06%。10μg·L^-1TNF-α刺激成纤维细胞24h能显著地上调细胞表面PDGFR-β的阳性表达率,此时的阳性表达率为41.13±5.30%。单独使用100mg·L^-1Pae刺激成纤维细胞24h后,PDGFR-β在人真皮成纤维细胞上阳性表达率可显著上调至37.35±0.31%。当使用10μg.L^-1TNF-α与不同浓度(10、50、100 mg·L^-1)Pae共刺激时,PDGFR-β阳性表达率分别为41.10±1.29%,39.96±0.91%,33.32±0.95%,结果与仅加10μg·L^-1TNF-α相比无统计学差异。上述结果表明,在TNF-α模拟的创面难愈内环境中,PDGFR-βmRNA的表达量和受体在细胞表面的阳性表达率显著上调,受体数目的上调能够增强PDGF-BB效应,更大程度的发挥配体促进成纤维细胞迁移增殖等作用,促进创面的愈合。第二部分MMP-9在人真皮成纤维细胞中的表达及药物作用研究1.RT-PCR结果表明,MMP-9 mRNA在人真皮成纤维细胞中表达极弱或基本不表达。TNF-α可以诱导MMP-9 mRNA的表达,使其上调。TNF-α与不同浓度的Pae共孵育,Pae可以显著抑制TNF-α诱导引起的MMP-9 mRNA表达的上调,且呈现出良好的量效关系。2.Western blotting结果显示,MMP-9在正常人真皮成纤维细胞中表达很弱,10μg·L^-1TNF-α可使MMP-9表达显著上调。当TNF-α与不同浓度(10、50、100 mg·L^-1)的Pae共孵育时,MMP-9的蛋白表达出现显著下调,分别下调8.77%、14.04%和10.53%。上述结果表明,在TNF-α模拟的创面难愈内环境中,MMP-9的表达量显著升高,过高的MMP-9表达量会使得ECM过度降解,延长创面愈合时间。第三部分PDGF-BB在人真皮成纤维细胞中对MMP-9表达的影响及药物作用研究1.Western blotting结果证实,MMP-9在正常人真皮成纤维细胞中表达较弱,10μg·L^-1TNF-α可使MMP-9表达显著上调。当使用TNF-α与不同浓度(2、5、10μg·L^-1)的PDGF-BB共孵育时,PDGF-BB能够显著抑制TNF-α引起的MMP-9表达上调,其中高剂量(10μg·L^-1)PDGF-BB能够将MMP-9表达量极显著下调44.68%。100mg·L^-1 Pae与10μg·L^-1TNF-α时,也能够显著抑制TNF-α引起的MMP-9表达上调,使得MMP-9表达量下调48.94%。2.ELISA结果显示,正常人真皮成纤维细胞MMP-9分泌基础值较低,为2.328±0.005 pg·mL^-1,10μg·L^-1TNF-α刺激24h后,真皮成纤维细胞MMP-9分泌量显著上升至7.371±2.179 pg·mL^-1。不同浓度(2、5、10μg·L^-1) PDGF-BB与TNF-α共孵育均可显著降低TNF-α引起的MMP-9分泌增加。100 mg·L^-1Pae与TNF-α共孵育24h后,MMP-9分泌量也显著下降至2.325±0.001,接近分泌基础值。3.ELISA法检测人真皮成纤维细胞分泌TIMP-1结果表明,成纤维细胞TIMP-1分泌基础值为12.952±0.3161pg·mL^-1,10μg.L^-1TNF-α刺激24h后,TIMP-1分泌量上调35.01%;不同浓度(2、5、10μg.L^-1)PDGF-BB与TNF-α共孵育,TIMP-1出现分泌减少现象,100 mg·L^-1Pae与TNF-α共孵育24h后,TIMP-1分泌也出现减少现象,分泌量为12.321±1.093pg·mL^-1。4.分析人真皮成纤维细胞分泌MMP-9/TIMP-1比值得知,正常人真皮成纤维细胞分泌的MMP-9/TIMP-1基础值为0.180,10μg·L^-1TNF-α作用人真皮成纤维细胞24h后,比值上升至0.434。用不同浓度(2、5、10μg·L^-1)PDGF-BB与TNF-α共孵育后,MMP-9/TIMP-1比值下降,说明平衡向MMP-9减少的方向移动,10mg·L^-1Pae也具有和PDGF-BB相似的效果,能降低TNF-α引起的MMP-9/TIMP-1平衡偏移。上述结果表明,在TNF-α模拟的创面难愈内环境中,PDGF-BB能够显著降低MMP-9的表达和分泌,并促使MMP-9/TIMP-1恢复平衡,这可能是PDGF-BB促进创面愈合的机理之一。100 mg·L^-1丹皮酚对于MMP-9蛋白表达和分泌的下调作用与PDGF-BB相似,提示了其在治疗创面难愈方面具有良好的开发应用潜力。第四部分PDGF-BB对真皮成纤维细胞细胞表达细胞因子、趋化因子的影响及药物作用研究1.采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae对人真皮成纤维细胞分泌IFN-γ的影响,结果表明,人真皮成纤维细胞IFN-γ分泌基础值为28.704±4.4E-15 pg·mL^-1,单独使用10μg·L^-1pDGF-BB刺激,分泌量下调12.68%。不同浓度（10、50、100 mg·L-1）)的Pae分别与PDGF-BB共孵育后,与对照组相比,50mg·L-1Pae能显著增加IFN-γ分泌量。2.采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae对人真皮成纤维细胞分泌IL-6的影响,人真皮成纤维细胞IL-6分泌基础值为193.965±22.634 pg·mL^-1;单独使用10μg.L^-1IPDGF-BB刺激,IL-6分泌值上调至238.513±11.568 pg·mL^-1。不同浓度（10、50、100 mg·L-1）的Pae分别与PDGF-BB共孵育,IL-6分泌值均有显著下调。3.采用ELISA法考察了PDGF-BB及Pae对人真皮成纤维细胞分泌IL-8的影响,人真皮成纤维细胞IL-8分泌基础值为755.042±34.113 pg·mL^-1;单独使用10μg·L^-1pDGF-BB刺激,IL-8分泌值上调至1025.120±71.775 pg·mL^-1上调35.77%。,Pae与PDGF-BB共孵育,与对照组相比,IL-8分泌量均有所下调,其中,10 mg·L-1Pae下调极为显著,50、100 mg·L-1Pae分别将IL-8分泌量下调20.49%和22.73%。上述结果表明,PDGF-BB可以诱导人真皮成纤维细胞产生细胞因子IL-6、IL-8。同时对抗炎因子IFN-γ的分泌起到抑制作用。增强炎症反应也可能是PDGF-BB促进创面愈合作用的机理。丹皮酚能够显著抑制PDGF-BB引起的人真皮成纤维IL-6、IL-8分泌上调,显示了其具有良好的抗炎活性。若在临床合理利用丹皮酚抑制IL-6、IL-8的药理特性可能减少愈合过程中瘢痕的形成。