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目的:昼夜节律广泛存在于所有的哺乳动物,生物钟是调控该节律的内源性起搏点。核心钟基因主要包括Bmal1、Clock、Per、Cry、Rev-erbα和RORα,并形成复杂的调控环路,协同参与形成周期性节律。骨骼肌具有昼夜节律,核心钟基因和肌调节因子参与调节骨骼肌的发育成熟,但其具体机制有待进一步研究证实。昼夜节律紊乱和众多疾病相关,如癌症,尤其是恶液质的晚期癌症患者会出现脂肪组织和骨骼肌不断分解消耗,持续体重下降并伴发有炎症反应。炎性刺激条件下钟基因和骨骼肌萎缩之间的关系也尚不清楚。本研究拟用RT-PCR和Western blot等方法观察核心钟基因在不同胎龄小鼠胚胎和C2C12成肌细胞诱导分化过程中的时空表达特点,分析骨骼肌发育分化过程中Bmal1、Clock和肌调节因子之间的关系;观察LPS炎性刺激对C2C12成肌细胞诱导分化过程中钟基因和骨骼肌发育分化相关基因的影响,阐明炎性刺激抑制肌管融合可能的机制。方法:1.收集胎龄10~17d ICR小鼠全胚胎和C2C12成肌细胞诱导分化不同时间细胞的RNA,反转录cDNA为模板,定量RT-PCR分析5个核心钟基因Bmal1、Clock、Per1、Cry1、Rev-erbα及肌调节因子MyoD、myogenin、Tcap、MAZ的表达规律。2.Western blot检测C2C12成肌细胞诱导分化48h、96h和144h BMAL1、CLOCK和MYOD蛋白的表达变化。3.质粒共转染、荧光素酶报告基因分析Bmal1、Clock和肌调节因子MyoD之间的关系。4.C2C12成肌细胞诱导分化过程中,分别给予0.1μg/mL LPS和1μg/mL LPS,RT-PCR分析LPS刺激过程中5个核心钟基因钟基因Bmal1、Clock、Per1、Cry1、Rev-erbα和肌调节因子MyoD、myogenin、myostain、Tcap、MAZ的表达变化规律。Western blot检测LPS刺激48h、96h和144h BMAL1、CLOCK蛋白的表达变化。结果:1.小鼠胚胎发育第11~12d,Bmal1、Clock、Per1低表达,胎龄增加随之升高,尤以Per1显著;发育后期,Bmal1、Clock表达水平小幅升高;胎龄17d,Per1的表达水平约达胎龄15d的3倍以上;然而Rev-erbα始终呈略高于基线的低水平表达,Cry1的表达水平仅略高于Rev-erbα。随着小鼠胚胎发育成熟,肌调节因子MyoD、myogenin的表达逐渐增强,尤以myogenin增长迅速,胎龄17d达高峰;MyoD在胎龄15d达小高峰后下降;MyoD达小高峰同步Tcap的表达明显增高,提示肌节开始发育。MAZ维持高水平持续增长,可能参与调节骨骼肌的发育成熟。2.C2C12成肌细胞诱导分化过程中,随着肌管形成Bmal1和Clock同步波动性升高;Cry1小幅同步升高,诱导分化120h达小高峰后下降;Per1的表达仅略高于Rev-erbα,二者小幅低水平波动。诱导分化过程中,MyoD、myogenin呈上升趋势,尤以myogenin显著,提示C2C12成肌细胞诱导分化模型有效。Western blot结果显示,BMAL1、CLOCK在C2C12成肌细胞诱导分化前后持续高表达,可能利于维持肌调节因子的活性。C2C12成肌细胞诱导分化前后,MYOD的表达没有统计学差异,MyoD决定成肌细胞的命运,诱导多核肌管的伸长和融合。3.质粒共转染结果表明,Bmal1、CLOCK与MYOD存在协同激活TCAP荧光素酶活性,Bmal1、Clock与骨骼肌特异性肌调节因子共同作用促进骨骼肌的发育分化。4.C2C12成肌细胞诱导分化过程中,LPS炎性刺激导致钟基因mRNA表达水平整体呈时间依赖性下降,Bmal1、Clock最为显著;Per1和Cry1在小范围内下降;LPS炎性刺激初始24h,Rev-erbα表达水平小幅升高,随后时间依赖性下调。LPS 0.1μg/mL组和1μg/mL组炎性刺激前后不同时间,BMAL1和CLOCK蛋白始终呈高表达;LPS0.1μg/mL组和1μg/mL组之间,钟基因Bmal1、Clock mRNA表达和二者蛋白表达并未呈现出浓度依赖性。5.C2C12成肌细胞诱导分化过程中,LPS持续刺激,MyoD和myogenin mRNA表达整体呈现出下降趋势,120h后,二者的下调趋势更显著。LPS炎性刺激降低了Tcap的表达水平,72h后Tcap维持在相对恒定水平,提示肌节的发育分化受到抑制。LPS炎性刺激条件下,MAZ的表达变化趋势与肌调节因子不一致,24h小幅升高后呈波动性下降。LPS炎性刺激120h后,与对照组比较1μg/mL组myostain的表达显著增加,myostatin可能参与抑制肌管融合。结论:1.钟基因与骨骼肌的发育分化之间存在耦联,核心钟基因Bmal1、Clock和MyoD均是成肌细胞诱导分化的关键调节子,对骨骼肌的发育分化发挥重要作用。2.持续表达的Bmal1利于维持肌调节因子的活性。3.低水平的Rev-erbα利于骨骼肌发育分化;胚胎发育过程中持续高表达的Per1可能参与抑制周期性节律的建立,有利于骨骼肌和其它组织器官的发育。4.LPS作为炎性介质时间依赖性抑制C2C12成肌细胞的分化,但是并没有降低BMAL1和CLOCK蛋白表达水平,可能与BMAL1和CLOCK蛋白在LPS抑制肌管融合过程中发挥保护作用有关。