电致化学发光(Electrochemiluminescence,简称ECL)是利用电极提供能量直接使电极表面发光物进行氧化还原反应而形成激发态,并由激发态返回到基态所产生的发光现象。该技术具有灵敏度高、可控性强等优点,可以根据发光试剂及生物元件不同构建多种传感器,应用于生物分析和临床检测中。在此基础上发展起来的电致化学发光成像不仅可实现高通量可视化生物分子检测,还可实现时空分辨的单细胞中生物分子分析,成为当前单细胞分析领域的一个新型研究热点。目前进一步发展电致化学发光成像的难点在于如何获得更强的发光信号,从而提高分析的空间分辨率和分析通量。本论文针对该领域的技术难点,开发出一系列可增强电致化学发光的电极界面和化学发光探针,实现了生物分子在溶液及单细胞中的快速和灵敏检测。主要研究内容如下:1.纳米锥电极尖端增强电致化学发光用于超高密度传感分析本章实现了纳米锥电极尖端增强电致化学发光可视化分析,从而达到超高密度电化学传感分析的目的。在纳米尺寸针尖处所获得的局部增强发光信号归因于:与针尖周围的平面区域相比,发光体在针尖处的传质速率得到了增强,进而在针尖处获得更强的发光信号。光斑的尺寸限制在15 μm内,使得电化学分析的密度大于4×103 spots/mm2。针尖的发光强度与H2O2浓度之间的正相关性为利用纳米锥电极阵列用于电致化学发光(ECL)定量分析提供了可行性依据。进一步在电极表面修饰葡萄糖氧化酶,通过尖端发光信号的变化可以对葡萄糖的浓度在0.5-5 mM范围进行定量,这一结果表明该纳米锥电极阵列可以进一步应用于复杂生物体系中多个分子的检测。本章中成功实现的局部ECL为发展超高密度的电化学阵列提供了一种新型无需复杂芯片设计的策略。2.增强型环金属铱(Ⅲ)配合物电致化学发光在生物分析中的应用为了进一步提高电致化学发光效率,发展新型探针分子和发光策略至为重要。本章合成了包含两个三齿配体[2,2’:6’,2"-三吡啶(tpy)和1,3-双(1H-苯并咪唑-2-基)苯(bbbiH3)]的环金属铱(Ⅲ)配合物1([Ir(tpy)(bbbi)]),首次观测到聚集诱导的电致化学发光现象(AI-ECL)。其晶体结构表明相邻的[Ir(tpy)(bbbi)]分子通过π-π-堆积相互作用和氢键连接,这些超分子相互作用可促进配合物1在水溶液中自组装形成纳米颗粒。这些纳米粒子中分子振动的有效限制导致配合物1的强AI-ECL发射。在二甲基亚砜-水混合溶剂中,当水含量从20%逐渐增加到98%时,配合物1电致化学发光(ECL)强度增加约39倍;比相同的实验条件下[Ru(bpy)3]2+的强度高～4倍。此外,牛血清白蛋白与配合物1的纳米颗粒的结合可改变该配合物的ECL强度,从而将AI-ECL成功运用于生物分析中。3.垂直有序的纳米均孔膜限域电致化学发光成像分析单细胞外泄过氧化氢单细胞电致化学发光成像分析对于原位检测细胞中分子分布及动态变化等均有关键性作用。但是,由于存在鲁米诺(Luminol)和活性氧中间体的扩散,无法对细胞微区中生物分子的分布进行准确成像分析。针对空间分辨率受限这一挑战,本章在ITO电极上生长了一种由高度垂直有序的平行纳米通道组成的二氧化硅均孔膜(SMCs),实现了 luminol和H2O2的限域电致化学发光,并用于成像单个活细胞外泄H2O2。ITO电极上负载的垂直有序的孔道限制了电致化学发光过程中产生的中间体的横向扩散。因此,使得来自微区附近的发光强度的交叉作用最小化,有望实现更高空间分辨率的单细胞电致化学发光成像。在SIM/ITO电极上,H2O2的可视化检测限低至5μM;而且,可以有效的检测单个活细胞外泄的H2O2。4.基于阻抗变化的局部增强型电致化学发光用于细胞表面无标记抗原成像利用免疫识别策略的电致化学发光单细胞成像可灵敏、特异性检测细胞表面的肿瘤标记物(抗原),但多采用标记方法,可能干扰抗原分子在细胞表面的分布。在本章工作中,我们首次构建基于阻抗变化的局部增强型电致化学发光成像(I-ECL)平台,实现单个细胞膜上抗原的免标记成像。该策略利用抗体与细胞膜表面的抗原结合后引起的局部阻抗改变,从而影响该区域双电层电压降(AV)及对应的电致化学发光强度。在磷酸盐溶液体系中,当施加电压频率增大到1.5 kHz时,所产生的电致化学发光强度变化最大,实现对CEA抗原低至1pg/ml的免标记成像分析。进一步应用该方法到单细胞成像,也成功实现了对单个细胞膜表面CEA的成像分析。与传统的ECL免疫方法相比,我们所建立的方案将为免疫分析提供一种新的途径,且有望实现单分子检测。