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EB病毒(Epstein Barr，EBV)感染B细胞后能使其获得无限增殖能力形成B淋巴母细胞系(B Lymphblastoid cell line，B-LCL)，B-LCL在免疫遗传学领域有广泛的应用。近年来人们逐步尝试用EBV永生化B细胞的方式制备单克隆抗体，这一方法较之传统的杂交瘤技术、噬菌体展示技术等具有材料来源广泛，筛选速度快的特点，因此在单克隆抗体生产领域应用前景广阔。实现B-LCL的单克隆培养是用EBV永生化B细胞制备单克隆抗体的关键一步，但由于这种B细胞在细胞浓度很低时不易存活，传统的有限稀释法不易实现其单克隆化，为此我们希望通过建立饲养层细胞的方式解决这一问题。 饲养层细胞是用于体外细胞培养的一类细胞，主要通过模拟细胞生长的体内环境的方式实现体内细胞的体外培养。有研究表明在外周血B淋巴细胞体外培养时用表达CD40L的3T3细胞作为饲养层可以实现其体外存活，尝试用这种方法来实现EBV永生化的B细胞的单克隆化培养。但目前并没有商业化的表达CD40L的3T3细胞，因此需要建立一株稳定表达CD40L的3T3细胞系，并探讨该细胞系应用于EB病毒永生化B细胞单克隆化培养的可行性。 主要实验成果: (1)制备了一批EB病毒液，经Q-PCR法测定病毒浓度为107 copies/ml。用环保霉素A去除T细胞法经EB病毒感染PBMC得到一株永生化成功的B-LCL。 (2)通过脂质体转染法将PcMV6-entry-CD40L转入NIH3T3细胞，通过G418药物压力筛选得到四个细胞株，经过多次传代后进行了细胞活性测定及RNA、Western的鉴定，确定了改造的四株细胞系均能稳定表达CD40L且活性良好。 (3)选定B细胞分化发育相关标记分子CD19、CD20、CD38、CD138、CD27作为细胞分化的指示，用免疫荧光染色法检测了EBV感染对B细胞表面标记的影响及NIH3T3-CD40L作为饲养细胞对B-LCL细胞标志的影响;同时结合Elisa技术检测了饲养细胞对B-LCL抗体分泌的影响。流式细胞仪检测结果显示使用饲养层细胞不影响永生化B细胞表面标志蛋白的变化，Elisa结果显示饲养细胞不影响B-LCL的抗体分泌，说明本实验所建立的饲养细胞可做为抗体制备用的B-LCL单克隆化饲养细胞。 (4)通过细胞数量梯度实验探讨了NIH3T3-CD40L细胞作为饲养层细胞在B-LCL单克隆化中的培养条件，结果显示建成的NIH3T3-CD40L细胞系至少能支持1.6个EB病毒永生化的B细胞存活并发生增殖，未添加饲养层的细胞在细胞接种数为50的情况下仍不能存活，说明建立的饲养细胞对B-LCL单克隆化有很好的支持作用。 本实验中建立的一株汉族健康人血来源的B-LCL，添加了中华民族永生化细胞库的库容量;建立了能稳定表达CD40L的NIH3T3细胞系;经过验证，建立的NIH3T3-CD40L细胞系能较好应用于B-LCL的单克隆化培养。