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器官移植是治疗晚期器官衰竭患者的有效措施,但由于可用的人体器官来源有限,一直限制着其广泛应用,随着器官衰竭患者的增加,供需矛盾越来越突出。利用动物器官不失为一条很好的解决途径。异种器官移植的理想器官供体是猪。虽然,存在种属间的不相容性,但由于猪的器官在解剖与生理方面与人的器官更为相近,被认为是最适宜的异种器官来源。由于种属间关系较远,人对猪的器官会发生排斥反应,包括超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR),急性血管性排斥反应(acute vascular rejection,AVR),及慢性排斥反应(chronic rejection,CR)。HAR的发生主要是由于受者体内存在的天然抗体,识别猪血管内皮细胞表面的Galα1,3Gal引起的。除了人、猿和旧大陆猴,几乎所有哺乳动物细胞表面均表达Galα1,3Gal抗原。AVR的发生与抗体也有密切的关系,包括抗Gal抗体和抗非Gal抗体。对CR的研究较少,但明确的是人体内的T细胞通过直接识别和间接识别途径,被激活后引发的炎症反应在CR中起到重要的作用。克服异种移植免疫排斥的研究有很多,其中去除猪细胞表面的Galα1,3Gal抗原、通过转基因技术在猪细胞上表达人的补体成分(如CD55,CD59等)和HLA-E,G分子等、使用药物抑制补体活性和免疫排斥反应等方法都取得了明显的疗效,获得了学术界的肯定。台湾的Jang-Ming Lee等将HLA-DPDQ基因导入猪,减少了慢性排斥阶段的细胞反应。人的MHC分子是HLA,即人白细胞抗原,分为Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ类分子,其中Ⅰ类包括HLA-A,-B,-C,-E,-G,-F等,Ⅱ类包括HLA-DR,-DP,-DQ等,Ⅲ类位于I类区域与I类区域之间,主要有补体C2、C4A、C4B(complement component C2、C4A、C4B)等,是与HLA无关的非HLA分子,仅习惯上列为Ⅲ类分子。HLA分子在调解免疫上发挥着重要作用,其中HLA-DRB1分子的作用更为突出。本研究的目的是探索HLA-DRB1分子在猪细胞上表达的可行性,为以后研究利用HLA-DRB1分子抑制免疫排斥反应打下基础。第一部分:HLA-DRB1*09的筛选目的:从人群中筛选到HLA-DRB1位点是09的个体。方法:使用HLA基因分型技术PCR-SSO和PCR-SBT,对人群的HLA-DRB1位点进行分型。结果:确定了表达HLA-DRB1*09的个体。结论:HLA分子生物学分型技术有效、快捷的找到了HLA-DRB1*09的个体,其HLA-DRB1基因型是090102和0101。第二部分:HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体的构建及鉴定目的:构建HLA-DRB1*0901及HLA-DRA基因真核细胞双表达载体,并对其是否表达鉴定。方法:用RT-PCR的方法从人外周血淋巴细胞的mRNA中逆转录扩增出HLA-DRB1*0901和HLA-DRA的cDNA, HLA-DRA经BglⅡ酶切插入真核表达载体pVITRO2的MCS1中,同时确认正反向,再在pVITRO2的MCS2中连入BamHⅠ酶切的HLA-DRB,确认正反向。将双表达载体转染猪肾细胞,western-blotting鉴定是否表达。结果:酶切和PCR分析鉴定,得到了pVITRO2-DRA-DRB1*0901双表达载体,western-blotting鉴定出有表达。结论:双表达载体pVITRO2可以在猪肾细胞中表达HLA-DRB1*0901。