【背景和目的】癌症是严重威胁人类健康和生命的疾病之一。肺癌是原发于肺部的肿瘤,近年来,随着吸烟和各种环境因素的影响,肺癌成为当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,且50%以上的肺癌临床诊断已属晚期。尽管目前的手术治疗、放射治疗及化学治疗取得了一定的进展,但肺癌患者的生存率并无明显改善。因此,迫切需要寻求新的诊断指标和有效的治疗方法。随着分子生物学研究的不断进展,RNA干扰作为一种新的、强有力的研究工具,在探讨基因功能和治疗人类疾病方面有着广阔的前景。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞后引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene silencing,PTGS)。dsRNA经核苷酸酶降解为长约21-23个核苷酸的小片段RNA,即小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),并以其为模板,特异性降解与该段RNA同源的信使RNA(messenger RNA,mRNA),从而抑制基因的表达。Akt即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,因其具有与蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)同源的序列,又被命名为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)。Akt是细胞体内多种信号转导通路的关键调节点,为3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)下游的靶蛋白。在大量的人类肿瘤中可以发现Akt信号通路的激活,且Akt的活化与肿瘤的预后有关。Akt的下游底物参与了蛋白合成、细胞周期调控、凋亡等重要的生物学功能,使得Akt成为肿瘤干预治疗的重要靶点。Akt有三种亚型:即Akt1、Akt2和Akt3。针对Akt及其亚型的功能进行研究发现三个Akt亚型均参与下游底物的活化,其中以Akt2为主。Akt2在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中均有较高的检出率。我们以Akt2为靶点,利用Akt2基因特异性siRNA,运用RNA干扰技术,观察其对人肺腺癌细胞A549中Akt2蛋白激酶表达是否具有抑制作用,对于肿瘤细胞的化疗药物敏感性是否产生影响,为进一步探讨该基因功能及肺癌治疗新方法提供实验基础。【方法】将构建好的siRNA载体通过脂质体2000转染人肺腺癌A549细胞,筛选稳定表达细胞株,将A549细胞分为siRNA干扰组,无关siRNA对照组和未转染空白组,RT-PCR法检测各组细胞Akt2的mRNA含量,用western blot法测定各组细胞的Akt2蛋白浓度,流式细胞术检测Akt2-siRNA干扰、紫杉醇应用对A549细胞的凋亡的影响。【结果】1.转染Akt2-siRNA的A549细胞的Akt2 mRNA的表达量明显低于空载体阴性对照组及未处理的A549细胞组,经过灰度扫描及统计学分析,差异具有统计学意义(P＜0.05)。2.提取稳定表达Akt2-siRNA、空载体干扰的A549细胞和未处理的A549细胞的总蛋白,经Western blot检测,表明转入Akt2-siRNA基因的Akt2蛋白的表达量明显低于空载体阴性对照组及未处理的A549细胞组,经过灰度扫描及统计学分析,差异具有统计学意义(P＜0.05)。3.Akt2-siRNA转染和紫杉醇作用48h均能明显促进A549细胞发生凋亡,并且紫杉醇诱导组A549细胞发生凋亡的效果明显强于Akt2-siRNA转染组,然而如果将稳定表达Akt2-siRNA的细胞株利用紫杉醇作用48h后,结果发现Akt2-siRNA联合紫杉醇诱导A549细胞凋亡的作用增强。【结论】1.Akt2-siRNA能明显下调人肺腺癌A549细胞的Akt2 mRNA的表达量。2.Akt2-siRNA能明显下调人肺腺癌A549细胞的Akt2蛋白的表达。3.Akt2-siRNA能明显诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,联合紫杉醇其诱导A549细胞凋亡的效果增强。