诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。同胚胎干细胞相比,它不仅具有广泛的细胞来源,还避免了伦理道德和免疫排斥问题,在细胞治疗和组织再生等方面具有广阔的应用前景。同小鼠或者人的iPSCs相比较,目前已报道建系的猪iPSCs还存在很多缺陷,深入研究猪iPSCs的分子调控机制,对猪iPSCs的建系和完善培养条件具有重要的意义。本研究通过分析mRNA-seq和miRNA-seq数据,筛选出调控关键多能基因的miRNAs,并研究其对猪iPSCs的调控作用,为优化猪iPSCs的诱导体系,获得原始态（Na?ve state）猪iPSCs提供新的思路。具体研究内容和结果如下:1.MiRNA和mRNA联合分析我们对三种不同培养条件下产生的猪iPSCs,包括piPS-L,piPS-F和piPS-LF,进行了miRNA测序,得到了165个特异表达的miRNAs。通过预测这些miRNAs的靶向mRNA,并通过GO和KEGG分析,发现部分靶向mRNA与干细胞多能性表达调控相关联。然后,对上述三种细胞的mRNA-seq数据进行分析,得到1416个特异表达的mRNAs。将上述miRNAs靶向mRNA和1416个特异表达的mRNAs进行联合分析,获得了猪iPSCs关键miRNA-mRNA靶点图,其中包括了16个miRNAs和对应靶向关系的13个mRNAs。2.靶向LIN28A基因miRNAs的验证及其在猪iPSCs中的调控作用根据miRNA-mRNA靶点图,我们对多能基因LIN28A展开进一步研究。首先,构建了3’UTR双荧光素酶报告系统,将miR-370,miR-31863分别与LIN28A 3’UTR报告载体共转293T细胞,36h后检测荧光素酶活性。结果显示,只有miR-370可以靶向多能基因LIN28A的3’UTR区。我们研究发现,猪iPSCs在分化过程中,LIN28A的表达降低,而miR-370的表达显著上调。利用构建的miR-370慢病毒表达载体感染猪iPSCs,我们发现miR-370可以抑制内源LIN28A的表达,并导致其他多能基因的表达降低,引起与干细胞分化相关基因的上调,使猪iPSCs的碱性磷酸酶活性和自我更新能力降低。回补LIN28A的实验,可以显著扭转上述miR-370的负调控作用。上述结果表明,miR-370可以靶向LIN28A,从而调控猪iPSCs的多能性状态。3.靶向调控OTX2基因miRNAs的生物信息分析及验证通过聚类分析,我们对不同培养条件获得的猪iPSCs的多能状态相关基因的表达谱进行了比较。结果表明,在测试的三种猪iPSCs中,激发态（Primed state）相关基因OTX2和ZIC3的表达量比原始态（Na?ve state）相关基因NANOG和ESRRB的表达量高5-10倍。我们通过三个miRNA靶基因预测平台,预测到6个可能调控OTX2基因的miRNAs。双荧光素酶实验结果发现,其中两个miRNAs（miR-1343和miR-545）可以特异性的靶向调控OTX2基因的3’UTR区。通过构建miRNA慢病毒表达载体,感染猪iPSCs,进一步证实了这两个miRNAs可以显著抑制OTX2 mRNA表达水平,从而抑制内源OTX2蛋白的表达。4.MiRNA-OTX2对猪iPSCs的调控作用本研究发现,miR-1343和miR-545可以促进猪iPSCs的增殖,提高碱性磷酸酶活性,上调多能基因SOX2,NANOG以及ESRRB的表达,抑制OTX2下游基因FGF5和OCT6的表达。通过EB分化实验,发现miR-1343和miR-545可以促进猪iPSCs向神经外胚层分化。在过表达miRNA的实验组中回补OTX2,可以扭转这两个miRNA的正调控作用。通过启动子双荧光素酶实验发现,OTX2可以抑制SOX2和ESRRB启动子活性。在过表达miR-1343或者miR-545的猪iPSCs中,SOX2和ESRRB的启动子活性可以被显著激活。我们还发现,SOX2可以抑制OTX2的启动子活性。进一步研究发现,SOX2和ESRRB可以促进miR-1343的表达,相反OTX2可以抑制miR-1343的表达,而miR-545的表达并没有明显的被上述转录因子调控。以上结果表明,miR-1343-OTX2调控轴参与调控猪iPSCs的自我更新和分化。