溶菌酶,又称为细胞壁溶解酶,由Fleming于1922年首次发现。目前国内使用的溶菌酶主要就是鸡蛋清溶菌酶(c-型),即直接从鸡蛋清中提取,此类溶菌酶不但生产成本高,产量低,而且它的抑菌谱也很窄,对革兰氏阴性菌的抑菌作用有所限制。近年来,我们从海参体内获得了一种新型溶菌酶,即i-型溶菌酶。该酶拥有较为广泛的抑菌谱,不仅可以抑制革兰氏阳性菌,也可以对革兰氏阴性菌有抑制作用。进一步对海参i-型溶菌酶基因结构以及氨基酸序列研究表明,在其完整基因中含有糖苷酶和异构肽活性,因此具有很大的应用价值。基因工程的最新进展使利用一些酵母细胞作为生物反应器高效表达外源基因成为可能,尤其是巴斯德毕赤酵母表达系统。毕赤酵母的醇氧化酶1(AOX1)基因的启动子具有强诱导性和强启动性,适于外源基因的高水平诱导表达;毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏好性,可进行细胞高密度培养,有利于大规模工业生产,因此使用毕赤酵母表达系统进行表达外源基因已成为目前的研究趋势。研究已证明,毕赤酵母密码子偏好性以及目的蛋白mRNA结构会影响目的蛋白的表达。本课题研究就是根据以上述两个原则对海参i-型溶菌酶基因进行优化,构建及筛选优良的毕赤酵母基因工程菌,对其进行发酵诱导表达及5 L发酵罐放大发酵生产海参i-型溶菌酶。本实验对海参i-型溶菌酶基因的优化分为两步。首先根据毕赤酵母密码子偏好性和密码子的简并性,将原始海参i-型溶菌酶基因在毕赤酵母中偏好性低于50%的密码子更改为偏好性较高的密码子。第二步,用生物信息学软件分别对原始基因以及优化后基因的mRNA结构进行预测,尽量打开其mRNA中的茎环结构,降低其自由能,以不降低密码子偏好性为前提,对第一步优化的基因进一步优化。为了便于后续的分离纯化,在优化后基因序列N端加六个His标签,将最终的新序列提交宝生物工程(大连)有限公司进行全基因合成。该合成的优化海参溶菌酶基因被命名为opt-SjLys,再将其基因片段与pMD18-T连接,构建克隆质粒pMD18-T-opt-SjLys。下一步将该质粒经双酶切,与表达质粒pPIC9K相连接,构建重组表达质粒pPIC9K-opt-SjLys。再采用电转化方式,将线性化的pPIC9K-opt-SjLys大片段导入毕赤酵母GS115中,即将目的基因整合至酵母细胞染色体上。将该转化液涂布于MD培养基平板,筛选出His~+转化子,再分别在抗生素G418(浓度为1 mg/ml和4 mg/ml)的YPD培养基上,筛选出高拷贝转化子。然后,接种该转化子菌株至YPD液体培养基发酵培养,并加入1%甲醇诱导培养96 h。发酵液经固液分离后,其上清液通过SDS-PAGE凝胶电泳分析,检测海参溶菌酶蛋白的表达效果。本实验共筛选出4株表达目的蛋白效率比较高的菌株。同时对实验室之前优化的菌株进行筛选,选择出一株最佳基因工程菌(HS3-1)进行发酵罐放大实验。采用5 L玻璃发酵罐,发酵初始培养基为基础盐培养基(BSM);甘油补料阶段流加甘油培养基(含1.2%PTM1微量盐溶液的50%甘油溶液),流加速率为18.15 mL/(L发酵液/h),流加5 h;甲醇补料阶段流加甲醇培养基(含1.2%PTM1微量盐溶液的甲醇溶液),发酵液中甲醇浓度通过在线控制在1%。通过调整发酵罐发酵工艺,确定较优的发酵工艺参数。结果发现,pH6.0,温度30℃,初始DO在30%左右,转速800-1000 rpm,甲醇浓度1%,甲醇诱导时间为96 h。在这个发酵工艺条件下,溶菌酶的表达量最高,且抑菌活性较摇瓶实验大幅度提高。本实验成功构建了较为高效地表达海参i-型溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌,摇瓶发酵所产溶菌酶的酶活8.79 U/mL,发酵罐发酵产溶菌酶活性为455.07 U/mL,经Ni~+柱纯化后酶活高达1833.33 U/mL,为后续更大规模放大培养提供理论依据和工艺技术基础。