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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是危害大黄鱼（Pseudosciana crocea）养殖的重要病原。本论文研究了大黄鱼内源性凋亡途径在细菌感染中的作用,为揭示内源性凋亡途径在抗细菌感染中的作用机制奠定了基础,也为进一步探索大黄鱼病害防治的新途径提供科学依据。通过简并引物、3’和5’RACE获得了大黄鱼内源性凋亡途径中的三个重要基因:cytochrome c（Lyccyt c）、caspase-9（Lyccasp9）和caspase-3（Lyccasp3）的全长cDNA。Lyccyt c编码104aa,其基因组含有2个外显子,1个内含子。Lyccasp9编码437 aa,包括三个结构域:Prodomain,90aa,包含CARD结构域;大亚基,133aa,包含组氨酸活性位点和半胱氨酸活性位点;小亚基,88aa。其基因组含有10个外显子,9个内含子。Lyccasp3编码285aa,包括两个结构域:大亚基,123aa,包含组氨酸活性位点和半胱氨酸活性位点;小亚基,共95aa。研究表明,重组Lyccasp9和Lyccasp3具有蛋白酶活性,证明它们具备caspase的基本性质。本实验中,我们首次在大黄鱼中对两个活性位点Lyccasp9的H249和C299及Lyccasp3的H132和C174进行了定点突变研究,其中对caspase组氨酸活性位点的定点突变研究在鱼类中未见报道。突变后的蛋白酶活性显著下降,证实了这两个残基的重要作用。RT-PCR分析显示,Lyccasp9和Lyccasp3基因在所检测的八个组织中为组成型表达。在Poly（I:C）或三联菌苗诱导下,Lyccasp9和Lyccasp3基因表达显著上调、进一步对Lyccasp9和Lyccasp3在组织中生物活性的测定,表明了内源性凋亡途径参与了大黄鱼的免疫过程。为了探明内源性凋亡途径在大黄鱼抗细菌感染中的作用,我们利用RNAi技术抑制了Lyccyt c和Lyccasp9的表达。通过Real-time PCR、Western blot、生物活性、TUNEL分析发现,Lyccyt c和Lyccasp9 dsRNA对大黄鱼的内源性凋亡途径有明显的抑制效果。在对Lyccyt c或Lyccasp9基因沉默后、感染嗜水气单胞菌条件下,这两个试验组的大黄鱼均在细菌感染后的4天内全部死亡,而注射GFP dsRNA和嗜水气单胞菌试验组及注射嗜水气单胞菌试验组均在细菌感染后的6天内全部死亡,注射PBS组死亡率只有20%左右。以上结果表明,在大黄鱼抗嗜水气单胞菌感染中、内源性凋亡途径引起的凋亡对大黄鱼有一定的保护作用。我们推测当嗜水气单胞菌侵入机体后、被细胞包裹,引起细胞凋亡,然后巨噬细胞进行吞噬,从而起到对机体的保护。同时还发现在内源性凋亡途径被抑制后,Lyccasp3基因的表达也受到了一定的抑制,进而抑制了细胞凋亡。另外还鉴定了大黄鱼两个新的CC型趋化因子,LycCC1和LycCC2。两者的序列一致性仅有17.7%,研究表明重组的LycCC1和LycCC2具有趋化活性。RT-PCR显示,LycCC1和LycCC2在所检测的9个组织中均为组成型表达。在Poly（I:C）或三联菌苗诱导下,LycCC1和LycCC2转录均明显上调、12h达到最高。我们发现Poly（I:C）对LycCC1的诱导比三联菌苗更为有效。研究表明,重组的LycCC1能诱导LMP10,MHC class Iαchain和β2m的高表达。由此可见,LycCC1不仅参与了Poly（I:C）或三联菌苗诱导的免疫反应,还参与了大黄鱼MHC class I抗原呈递途径的调节。我们还发现三联菌苗对LycCC2的诱导比Poly（I:C）更为有效,这与LycCC1有明显不同,这预示LycCC2更侧重于细菌诱导的免疫反应。