【摘 要】
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微管由α和β微管蛋白组装而成,是真核生物细胞骨架的核心组成部分,广泛影响细胞分裂、形态维持、细胞迁移和胞内运输等生命活动。微管蛋白的多种翻译后修饰是微管骨架的重要调节因素,它们通过调控微管与微管结合蛋白、分子马达互作进而调控微管功能。微管蛋白的去酪氨酸化/酪氨酸化修饰循环,是其中极为重要的一种翻译后修饰,它是指在羧肽酶和连接酶的作用下,α微管蛋白C末端酪氨酸被循环切割和再连接的过程。这种循环修饰是
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微管由α和β微管蛋白组装而成,是真核生物细胞骨架的核心组成部分,广泛影响细胞分裂、形态维持、细胞迁移和胞内运输等生命活动。微管蛋白的多种翻译后修饰是微管骨架的重要调节因素,它们通过调控微管与微管结合蛋白、分子马达互作进而调控微管功能。微管蛋白的去酪氨酸化/酪氨酸化修饰循环,是其中极为重要的一种翻译后修饰,它是指在羧肽酶和连接酶的作用下,α微管蛋白C末端酪氨酸被循环切割和再连接的过程。这种循环修饰是微管蛋白特有的一种翻译后修饰,修饰异常会导致癌症、心肌病和脑功能障碍等严重的人类疾病。因此,研究微管蛋白去酪氨酸化/酪氨酸化的酶,阐释其分子作用机理具有重要的理论与实践意义。目前,虽然微管蛋白酪氨酸化修饰的研究已较为全面,但微管蛋白去酪氨酸化的研究相对滞后。直至2017年,研究者首次发现,血管抑制素（VASHs）和血管抑制素结合蛋白（SVBP）形成的复合物发挥微管蛋白的去酪氨酸化功能,其中VASHs是水解酶,SVBP是不具有酶活性的必需辅助蛋白,然而这里面的酶活机制和辅助机制尚不清楚。为此,我们围绕“VASHs/SVBP复合物对微管蛋白去酪氨酸化的分子机制”开展研究,取得了以下结果:1.解析了VASH2/SVBP复合物以及其结合微管蛋白小尾状态的2个高分辨晶体结构我们摸索和优化了蛋白表达条件,利用昆虫细胞表达体系获得了表达量高、性质均一的VASHs/SVBP复合物蛋白,并通过RP-HPLC实验验证了复合物体外去酪氨酸化活性。经过大规模蛋白样品和结晶条件的筛选和优化,获得了衍射好的晶体,收取了晶体衍射数据,并采用单波长反常散射法确定了相位,解析了VASH2/SVBP复合物2.2?分辨率的三维结构。进一步筛选了一系列α微管蛋白小尾上的小肽作为底物,优化底物和VASH2/SVBP失活突变体共结晶条件,获得了优质的衍射数据,解析了分辨率为2.5?的微管蛋白小尾与VASH2/SVBP的三元复合物结构。2.揭示了SVBP稳定VASH2蛋白的结构机制我们基于结构分析了SVBP与VASH2互作界面的氨基酸,通过突变体构建及相应Pull-down实验,验证了一些互作氨基酸对VASH2的可溶性非常重要。联用晶体学与分子动力学模拟发现,水解酶VASH2的氨基端存在两个非常动态的α-螺旋破坏其稳定性,不具酶活的辅助蛋白SVBP结合并稳定这两个动态的α-螺旋,进而稳定VASH2,增强其酶活。综上所述,我们的结构揭示了一个协同模型,即SVBP与VASH2的广泛相互作用在稳定VASH2和增强其酶活方面起着至关重要的作用。3.阐明了VASH2/SVBP对α微管蛋白去酪氨酸化的分子机制我们发现与典型的转谷氨酰胺酶类半胱氨酸蛋白酶相比,VASH2有不同构象,并具有非典型的Cys-His-Ser催化三联体。在这个催化三联体中,一个水分子夹在丝氨酸侧链和组氨酸的Nε2H之间,定向组氨酸的咪唑环与半胱氨酸上的硫醇巯基形成硫醇-咪唑离子对,最终极化半胱氨酸上的巯基用于亲核攻击和切割酪氨酸。4.阐释了VASH2对α微管蛋白小尾的识别机制分析VASH2/SVBP复合物的表面电荷,发现在VASH2的Cys-His-Ser催化三联体口袋附近有由碱性氨基酸构成的连续带正电荷的凹槽区域,通过电荷反转突变分析,证明了VASH2活性口袋附近的碱性氨基酸对底物α微管蛋白C端小尾的识别和去酪氨酸化至关重要,剖析VASH2/SVBP与α微管蛋白小尾的复合物结构,证实了VASH2上的正电荷凹槽区域为识别α微管蛋白C端小尾进行去酪氨酸的区域。以上研究结果为理解微管蛋白去酪氨酸化酶VASH2/SVBP复合物对α微管蛋白去酪氨酸化的分子机制提供了结构信息,为深入研究微管蛋白去酪氨酸化酶对底物识别偏好性的分子机制奠定了坚实基础,为治疗人体微管蛋白酪氨酸化水平异常诱发的疾病和开发相关药物提供了理论依据。
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