糖尿病是一个日益威胁人类健康的以血糖升高为特点的代谢紊乱性疾病。糖尿病肾病是终末期肾病的主要病因,与肾小球、血管和肾小管损伤相关。高糖诱导肾小管上皮细胞加速衰老是导致糖尿病肾病肾间质损伤的重要细胞事件。二甲双胍是一种双胍衍生物,是II型糖尿病的一线口服治疗药物。二甲双胍具有抑制肠道葡萄糖吸收等多种降糖作用。同时,有研究表明二甲双胍能够部分逆转糖尿病肾病所致的肾损害。RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)是一类能直接与RNA结合的蛋白,通过与RNA结合形成核糖核酸蛋白复合物,调控RNA的生物学功能。MBNL1(muscleblind like splicing regulator 1,盲肌样蛋白1)是一个由343个氨基酸构成的RBP,定位于3号染色体q25.1-q25.2,在细胞中的定位失调是强直性肌营养不良的重要发病原因。MBNL1可与多种RNA结合,调控其选择性剪接、选择性聚腺苷酸化、稳定性和亚细胞定位。但目前尚无研究报道二甲双胍或MBNL1对糖尿病肾病衰老的作用与机制。MiRNAs是一种由21到25个核苷酸组成具有保守序列的小功能非编码RNA,通过与相应mRNA的3’UTR结合,抑制靶基因表达,从而调控细胞分化、增殖、凋亡、迁移等多种细胞生物学行为。miRNAs在调控糖尿病肾病的发病及相关并发症中同样发挥着重要的作用。MiR-130a-3p定位于11号染色体q12.a,研究表明miR-130a-3p在老年小鼠的血液与肝脏中表达降低。本研究通过RBPDB软件分析预测,发现MBNL1与miR-130a-3p存在潜在结合位点。STAT3(Signal transducers and activators of transcription 3,信号转导子和转录激活子3)是一种信号传导及转录激活因子,定位于17号染色体q21.2,与细胞表面的多肽受体作用发挥生物学效应。研究表明,STAT3在糖尿病肾病的发病机制中发挥重要作用,抑制STAT3的活性能够延缓糖尿病肾病的进展。本研究通过targetScan、RNA22、miRanda软件预测mi R-130a-3p与STAT3存在潜在的结合位点,但miR-130a-3p与STAT3的作用机制尚未见报道。本研究首先探讨MBNL1、miR-130a-3p、STAT3在糖尿病肾病中的内源性表达,以及与肾小管上皮细胞衰老的关系,明确MBNL1、miR-130a-3p、STAT3分子间的调节方式,在此基础上进一步研究二甲双胍是否通过MBNL1/miR-130a-3p/STAT3途径发挥对肾小管上皮细胞衰老的保护作用。本研究为糖尿病肾病的发病机制以及二甲双胍对糖尿病肾病的治疗提供新的理论和实验依据。方法:第一部分:体外培养人肾小管上皮细胞,分别应用正常糖(D-葡萄糖浓度为5.56mmol/L)、高糖(D-葡萄糖浓度为30mmol/L)、高渗(D-葡萄糖浓度为5.56mmol/L,甘露醇浓度为24.44mmol/L)培养基进行培养。β半乳糖苷酶原位染色,Western Blot检测衰老相关蛋白观察比较各组细胞衰老水平,建立并验证人肾小管上皮衰老模型。应用慢病毒及嘌呤霉素构建敲降MBNL1、过表达MBNL1、敲降STAT3和过表达STAT3稳转细胞系,并用lipofectamine 2000转染miR-130a-3p mimics和miR-130a-3p inhibitor。应用Real-time PCR及Western blot验证转染效率。应用Western Blot检测衰老相关蛋白,探讨MBNL1、miR-130a、STAT3及其相互作用对细胞衰老的影响。应用RIP、新生RNA检测等实验验证MBNL1与miR-130a-3p的相互结合作用,荧光素酶报告基因实验检测miR-130a-3p对STAT3的调控。第二部分:应用1mmol/L二甲双胍刺激细胞2小时,建立二甲双胍组,并检测细胞衰老水平。应用Real-time PCR、Western blot及第一部分中构建的转染细胞系,验证二甲双胍通过MBNL1、miR-130a、STAT3对细胞衰老的延缓作用。第三部分:应用雄性db/m小鼠和db/db小鼠结合二甲双胍给药在体内进行验证。分别于周龄8周、16周、24周时,处死小鼠并取出肾脏标本,包埋并制作石蜡切片。经HE、PAS、Masson染色等常规病理手段检测病变程度,β-半乳糖苷酶原位染色检测细胞衰老情况。并应用免疫组化的方法检测MBNL1与STAT3的表达,原位杂交法检测miR-130a-3p的表达。实验结果:第一部分:在作用24h和48h时,高糖组与高渗组、正常糖组的细胞衰老程度无显著差异。72h时,高糖组细胞衰老程度显著高于正常糖组及高渗组。因此选择72h为高糖诱导人肾小管上皮细胞衰老的最佳时间点。与正常糖组相比,高糖组HK-2细胞中MBNL1及mi R-130a-3p的表达显著降低,STAT3表达显著升高。在高糖状态下,MBNL1、miR-130a-3p及沉默STAT3均能够延缓细胞衰老。RIP、新生RNA等实验证实了MBNL1可以特异性结合miR-130a-3p并增加其稳定性。进一步的Western blot实验证实下调miR-130a-3p能够逆转MBNL1对细胞衰老的延缓作用。荧光素酶报告基因等实验证实了miR-130a-3p可以与STAT3的3’UTR区靶向结合并负性调控其表达。进一步的Western blot实验证实STAT3能够逆转miR-130a-3p对肾脏衰老的延缓作用。第二部分:高糖+二甲双胍组P21蛋白的表达和β-半乳糖苷酶染色阳性率均显著低于高糖组。二甲双胍能够上调高糖状态下细胞中MBNL1、miR-130a-3p的表达并降低STAT3的表达。而且沉默MBNL1、下调miR-130a-3p及上调STAT3的表达均可以逆转二甲双胍对肾小管上皮细胞衰老的抑制作用。二甲双胍可以上调MBNL1的表达增强其与miR-130a-3p的结合作用延缓细胞衰老。二甲双胍可以上调miR-130a-3p的表达增强其对STAT3的负性调控作用延缓细胞衰老。第三部分:在体内实验中,随着周龄的增加,db/db糖尿病小鼠组空腹血糖和血清肌酐显著升高,肾脏HE染色显示肾小球肥大,PAS染色显示肾小球系膜基质增多,Masson染色显示肾小管间质纤维化加重,肾小管上皮细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高,肾小管上皮细胞的MBNL1和mi R-130a-3p表达显著降低,STAT3表达显著增加。而二甲双胍治疗能够下调小鼠空腹血糖和血清肌酐水平,减轻HE、PAS、Masson染色所示的病变,并上调MBNL1和miR-130a-3p的表达,下调STAT3的表达。结论:1.高糖可以诱导人肾小管上皮细胞衰老。2.MBNL1和miR-130a-3p在高糖诱导的人肾小管上皮细胞中低表达;STAT3在高糖诱导的人肾小管上皮细胞中高表达。3.MBNL1和miR-130a-3p及下调STAT3,可以延缓高糖诱导的人肾小管上皮细胞衰老。4.MBNL1可以通过特异性结合mi R-130a-3p,增加mi R-130a-3p的稳定性。STAT3是miR-130a-3p的靶基因。5.高糖可以通过MBNL1/miR-130a-3p/STAT3途径诱导人肾小管上皮细胞衰老。6.二甲双胍可以延缓高糖诱导的人肾小管上皮细胞衰老。7.二甲双胍通过上调MBNL1的表达增强其与miR-130a-3p的结合作用延缓高糖诱导的人肾小管上皮细胞衰老。8.二甲双胍通过上调mi R-130a-3p的表达增强其对STAT3的负性调控作用延缓高糖诱导的人肾小管上皮细胞衰老。9.二甲双胍可以通过MBNL1/miR-130a-3p/STAT3途径延缓高糖诱导的人肾小管上皮细胞衰老。10.MBNL1、miR-130a-3p在db/db小鼠衰老肾小管上皮细胞中低表达;STAT3在db/db小鼠衰老肾小管上皮细胞中高表达。11.二甲双胍可以通过MBNL1/miR-130a-3p/STAT3途径延缓糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞衰老。