背景:近年来,越来越多的研究表明,产碳青霉烯酶基因在各种移动元件的帮助下实现大范围迅速播散是耐碳青霉烯大肠埃希菌（Carbapenem-resistant Escherichia coli,CR-EC）在世界范围内传播的主要原因。其中,新德里金属β-内酰胺酶（New Dellhi metallo-β-lactamase,NDM）,是所有碳青霉烯酶中得到最广泛的关注。自英国科学家Walsh于2007年在印度新德里分离出第一株产NDM肺炎克雷伯杆菌中发现以来,已鉴定出24种NDM亚型。NDM能水解所有含β-内酰胺环的抗生素,包括碳青霉烯酶。体外药敏发现,产NDM细菌常只对多粘菌素和替加环素敏感。这类细菌的出现使感染类疾病更加不可治疗和控制,导致全球对产NDM细菌感染的高度关注。但本地区NDM阳性大肠埃希菌感染（Escherichia coli,E.coli）的患病率、传播机制、菌株克隆相关性、院内爆发情况以及感染危险因素和临床转归尚不清楚。目的:1.了解CR-EC临床分离株5年内流行情况和耐药机制;2.分析携带NDM基因的CR-EC临床分离株的水平传播机制;3.研究CR-EC NDM基因的周围环境;4.评估感染产NDM-5基因碳青霉烯耐药大肠埃希菌的住院患者危险因素和临床转归情况。方法:1.收集重医附一院2013/1/1-2017/12/31获得的CR-EC,同一病人仅需一株。所有分离株均使用VITEK MS（bioMerieux,Hazelwood,MO美国）自动化系统鉴定到种水平,常规药敏试验由VITEK2 compact（bioMerieux,Inc,Durham,NC）机器检测,并使用微量肉汤稀释法验证菌株对抗生素的最低抑菌浓度（MIC）;2.聚合酶链反应（PCR）检测CR-EC存在的耐药机制:首先运用Primer5.0设计多种耐药基因引物,包括碳青霉烯酶基因(bla_KPC、bla_NDM、bla_VIM、bla_IMP和bla_OXA-48),产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因、AmpC基因,以及膜孔蛋白基因（ompF、omp C）,然后PCR反应,最后测序验证这些基因的具体亚型;3.运用质粒接合和转化实验初步判断NDM基因的位置并评估NDM基因的可转移性;同时采用Mult-PCR检测复制子,确定携带bla_NDM的CR-EC质粒型别。4.为了从分子水平上解释耐药基因水平传播机制,采用PCR的方法对NDM基因周围环境进行测序分析,并将测序结果上传至NCBI数据库进行Blast比对注释。5.同时采用脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE）和多位点序列分型（Multiple Locus Sequence Typing,MLST）实验进行分子流行病学分析。6.采用回顾性病例对照研究来评估感染产NDM-5大肠埃希菌患者的独立危险因素和预后。结果:1、2013/1/1-2017/12/31,附一院共分离到非重复CR-EC109株,这些细菌主要来自尿液标本（n=41）,其次是呼吸道样本（n=18）、引流液（n=13）、分泌物（n=12）、血液（n=12）、胆汁（n=8）和腹水（n=5）等。2、体外药物敏感性分析结果显示,109株CR-EC对厄他培南的耐药率最高（97.3%）,57.8%对亚胺培南耐药,55.9%对美罗培南耐药率。几乎所有的CR-EC分离株对头孢菌素,尤其是头孢曲松具有很强的耐药性,耐药率为100%。分别有93.6%和92.7%的菌株对头孢他啶和头孢吡肟耐药。此外,半数以上的CR-EC菌株对氨基糖苷类和庆大霉素类抗生素耐药。此外,22%细菌对多粘菌素耐药,未发现细菌对替加环素耐药。3、耐药基因检测发现,109株CR-EC中,50株大肠埃希菌bla_NDM基因阳性,其中bla_NDM-5是最常见的亚型（41/50,82.0%）,bla_NDM-1阳性率较低（8/50,16.0%）,仅一株大肠埃希菌携带bla_NDM-9基因（1/50,2.0%）。此外,我们观察到一株细菌同时表达bla_NDM-5和bla_KPC-2。除了产碳青霉烯酶外,76.2%（83/109）的分离株为ESBLs阳性,bla_CTX-M为最常见的ESBLs基因,其中以bla_CTX-M-1最为普遍。同时,ompC和ompF的表达缺失在CR-EC中并不常见.4、bla_NDM基因均能成功进入转化子和接合子,质粒分型显示大部分质粒属于IncF型。5、NDM基因环境检测显示,所有携带bla_NDM质粒存在一个高度保守的序列,即bla_NDM-ble_MBL-trpF-tat。6.多因素Logistic回归分析显示,转院病人、多种细菌混合感染、泌尿系统疾病和既往碳青霉烯类抗生素暴露是产NDM-5大肠埃希菌感染的独立危险因素。结论:1.产NDM大肠埃希菌对大多数抗生素耐药,表现出超强的泛耐药性,且它的耐药机制非常复杂。我院收集的CR-EC耐药机制以产碳青霉烯酶合并产ESBLs/AmpC联合ompC或ompF缺陷为主,耐药基因功能相互叠加,导致细菌耐药力更强。临床在制定抗感染方案时,除需参考菌株药敏结果外,还应考虑联合多种抗生素治疗,避免抗感染治疗失败。2.转化接合实验证实bla_NDM基因位于质粒上,IncF是本地区最常见的质粒型别,提示CRE的一个新的分子流行病学特征将在中国流行。3.携带bla_NDM基因的质粒存在一个高度保守的序列,即bla_NDM-ble_MBL-trpF-tat。四个基因串联表达可能是细菌产生耐药性的重要原因。在研发新的抗感染药物时,是否可以改变四种基因串联以阻断或减轻NDM基因的表达。;4.对转院病人、多种细菌混合感染患者、具有泌尿系统疾病和既往有碳青霉烯类抗生素暴露史的患者要警惕产NDM-5大肠埃希菌感染的可能。定期筛查产NDM-5大肠埃希定植、规范医疗操作、优化感控措施及时监测炎症指标,以避免感染发生。