真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及其在DC中的表达研究

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目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并转染树突状细胞(dendritic cell, DC),验证已转染的真核表达载体pEGFP-GPC3的DC高表达GPC3,为我们今后的HCC基因治疗实验打下坚实的基础。方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3中的GPC3基因全长扩增出来,再连接到PGEM-T载体上,最后将PGEM-GPC3载体单酶切和pEGFP-N1载体进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5a菌株,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析。结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC的细胞膜上有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(M r)大小约为67000的蛋白条带。结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础。
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