前脂肪细胞白色成脂分化过程中,胰岛素是关键的诱导因子。胰岛素信号主要通过Insulin-AKT-mTOR-PPARγ途径启动并持续调控白色前脂肪细胞成脂分化,与人和小鼠的成熟脂肪细胞去分化呈负相关。本实验室既往研究表明,体外诱导小鼠原代前脂肪细胞白色成脂分化过程中,去除外源性胰岛素可导致该分化进程停止,继而发生成脂细胞去分化,即其胞质中原已形成的脂滴变小并逐渐消失,成脂相关分子表达下调,脂肪干细胞因子上调,去分化细胞重获干细胞特性。细胞自噬参与脂肪细胞以及肝细胞中脂质的降解。基于mTOR是自噬信号途径的关键分子,因此我们推测:自噬在缺乏胰岛素所致的成熟脂肪细胞去分化过程中发挥重要作用。本文主要采用分子生物学方法,研究自噬在小鼠成熟脂肪细胞去分化中的作用机制。我们使用“经典鸡尾酒法”体外诱导3T3-L1小鼠前脂肪细胞白色成脂分化,共10天。在分化结束时(D10),添加胰岛素信号或自噬信号干预剂促使成熟脂肪细胞去分化,设为DD0,即D10与DD0为同一时间。既往我们的实验探讨了单纯抑制胰岛素信号和单纯促进自噬信号时的3T3-L1脂肪细胞去分化特点,对于较完整的揭示自噬在成熟脂肪细胞去分化中的作用机制有待深入开展。因此,本实验采用6种不同干预方法,进一步探讨自噬在成熟脂肪细胞去分化期间的作用,干预开始后,每两天换液一次,连续处理细胞12天(DD12),分组如下。1.非干预对照组,即仍然使用完全生长培养基(CGM),连续培养3T3-L1成熟脂肪细胞;2.单纯抑制胰岛素信号组,更换新CGM的同时添加OSI-906,抑制3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号;3.单纯诱导自噬组,更换新CGM的同时添加Rapa,诱导3T3-L1脂肪细胞自噬;4.单纯抑制自噬组,更换新CGM的同时添加Baf A1,抑制3T3-L1脂肪细胞自噬;5.抑制胰岛素信号的同时诱导自噬组,更换新CGM的同时添加OSI-906和Rapa,抑制3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号并诱导自噬;6.同时抑制胰岛素信号和自噬组,更换新CGM的同时添加OSI-906和Baf A1,同时抑制3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号和自噬。此外,为了验证去分化脂肪细胞的再分化能力,即其重获脂肪干细胞特性的能力,在去分化结束(DD12/RD0)时,使用含终浓度为1.7μM胰岛素的CGM诱导其成脂再分化,持续10天(RD10)。本论文实验结果如下。1.去分化和自噬干预实验的对照组(胰岛素信号未干预组):将成熟分化后的3T3-L1脂肪细胞继续在CGM中培养12天(D10/DD0~DD12)。期间成熟脂肪细胞胞质内脂滴持续增大,此现象与我们既往的实验结果一致。并且该组胰岛素信号关键分子AKT磷酸化水平、成脂相关分子C/EBPβ以及PPARγ的转录及翻译水平在整个过程中均较高,三者的表达均未受抑制,甚至进一步上调;此外,DD12时,P62的翻译水平较去分化开始(DD0)时显著上调(p<0.01),LC3的转录及翻译水平均较去分化开始(DD0)时显著下调(p<0.01),表明在此过程中,自噬水平总体下调。2.在3T3-L1脂肪细胞去分化开始(D10/DD0)至结束(DD12)的整个过程中,持续单纯抑制胰岛素信号可导致成脂分化进程停止,脂滴逐渐消失,DD12时,细胞成脂率由85.12±5.20%降至15.42±5.10%,多数原成熟脂肪细胞呈现成纤维细胞样形态。靶分子转录及翻译水平检测结果显示,与未干预组相比,胰岛素信号关键分子AKT磷酸化水平显著下调(p<0.05),OSI-906对胰岛素信号的抑制率为76.20±3.36%,成脂相关分子PPARγ、C/EBPβ的转录及翻译水平均明显下调(均为p<0.01),与实验室既往实验结果一致;干细胞标志分子CD105的转录水平显著上调(p<0.01);此外,脂滴融合相关分子FSP27的转录及翻译水平明显下调(p<0.05)。在此过程中,自噬标志分子LC3的转录及翻译水平均在早、中期(DD0~DD6)下调,晚期(DD6~DD12)上调,P62的转录及翻译水平均在早、中期(DD0~DD6)上调,晚期(DD6~DD12)下调。上述结果表明,76.20±3.36%抑制胰岛素信号可导致成熟脂肪细胞去分化,说明胰岛素信号与3T3-L1脂肪细胞去分化呈负相关,与既往我们使用原代细胞所做实验结果一致。3.从D10/DD0至DD12持续单纯促进自噬信号传导可造成胞质内部分脂滴丢失,仅有极少量成纤维细胞样细胞出现,细胞成脂率由85.12±5.20%降至50.26±2.05%。靶分子转录及翻译水平检测结果显示,AKT磷酸化水平显著下调(p<0.01),Rapa对胰岛素信号的抑制率为54.33±2.26%,PPARγ、C/EBPβ的转录及翻译水平均显著下调(均为p<0.05),与既往实验结果一致;此外,FSP27的转录及翻译水平也相应下调(p<0.05)。上述结果表明,促进自噬可以部分抑制胰岛素信号,促进成熟脂肪细胞去分化,但相较单纯抑制胰岛素信号组,其对胰岛素信号的抑制率较低并且去分化进程较缓慢。4.从D10/DD0至DD12持续单纯抑制自噬信号传导,细胞成脂率由85.12±5.20%降至65.27±2.19%。此外,抑制自噬对胰岛素信号分子AKT的磷酸化及成脂关键分子PPARγ、C/EBPβ的表达几乎无影响(p>0.05),由此说明,抑制自噬信号后,无法抑制胰岛素信号的传导,进一步说明了自噬在缺乏胰岛素信号所致的成熟脂肪细胞去分化中的作用。5.从D10/DD0至DD12持续抑制胰岛素信号传导的同时促进自噬信号传导,DD12时大多数成熟脂肪细胞呈现成纤维细胞样形态,细胞成脂率由85.12±5.20%降至10.21±3.01%。靶分子转录及翻译水平检测结果显示,相较于单纯抑制胰岛素信号组,AKT磷酸化水平显著下调(p<0.01),OSI-906与Rapa联合使用对胰岛素信号的抑制率为82.15±2.39%,此外,C/EBPβ的转录水平显著下调(均为p<0.01),但未对PPARγ的转录及翻译水平造成显著的抑制作用,CD105的转录水平有所上调。以上结果表明,同时抑制胰岛素信号及促进自噬,可进一步抑制胰岛素信号,说明二者可以协同抑制胰岛素信号传导,促进成熟脂肪细胞去分化。6.从D10/DD0至DD12持续抑制胰岛素及自噬信号传导,细胞成脂率由85.12±5.20%降至15.42±2.17%,但其含脂滴细胞数量稍多于抑制胰岛素信号并促进自噬信号组,且成纤维细胞样细胞数量少于单纯抑制胰岛素信号组。相较于单纯抑制胰岛素信号组,同时抑制胰岛素及自噬信号传导组,AKT磷酸化水平、PPARγ以及C/EBPβ的转录及翻译水平均未进一步受抑制。结果表明,同时抑制胰岛素信号及自噬信号,未能进一步抑制胰岛素信号,也无法进一步促进成熟脂肪细胞去分化。此外,在诱导去分化脂肪细胞再分化开始(DD12/RD0)至结束(RD10)的整个过程中,添加终浓度为1.7μM的胰岛素持续诱导其成脂再分化,我们成功获得了成熟脂肪细胞,细胞成脂率可达70.25±3.08%。结果表明,仅通过添加胰岛素足以重新启动去分化脂肪细胞成脂再分化,即胰岛素在白色成脂再分化中发挥关键作用。综上,我们的实验结果表明,insulin-mTOR-autophagy信号通路在成熟脂肪细胞去分化过程中发挥重要作用,其中,自噬可以反馈性抑制胰岛素信号传导,抑制AKT磷酸化,进而抑制成脂相关分子PPARγ以及C/EBPβ的表达,从而促进成熟脂肪细胞去分化。此外,去分化脂肪细胞可以再次诱导分化为成熟脂肪细胞,说明去分化脂肪细胞重新获得脂肪干细胞特征。