研究背景阿尔茨海默病(AD)是老年人常见的疾病之一,严重影响人类的身心健康,给患者家庭及社会带来了沉重的负担。近年来越来越多的研究显示,2型糖尿病与AD的发生及发展密切相关,Luchsinger等对1262名老年人群调查显示1/3的痴呆与糖尿病有关,相关流行病学调查发现,DM患者发生AD的危险性是非DM患者的2倍。糖尿病导致AD发生的机制与胰岛素细胞信号转导异常、高胆固醇血症及高血糖状态下非酶糖基化反应生成的糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)有关。糖的醛基和蛋白质的氨基经过复杂的非酶糖基化反应(Maillard反应)生成一类不可逆聚合物,即糖基化终末产物,AGEs在糖尿病视网膜病变、动脉硬化、糖尿病肾病等靶器官损害中发挥重要作用,而AD患者脑内老年斑和神经元纤维缠结中均发现有AGEs的聚积,Takeuchi和Maczurek等研究也指出,AGEs在糖尿病所致的认知功能障碍和AD病理变化中起着非常重要的作用,是引起老年人认知功能下降的危险因素之一。AGEs能够促进蛋白的聚积与交联,直接抑制蛋白的正常功能,并能够通过促进活性氧(reative oxygen species, ROS)的产生对机体造成生物损伤,除此之外还能与其特异性受体(主要是RAGE)结合进而通过一系列信号转导通路发挥其间接毒性作用。AD的典型病理改变是在特定脑区内出现老年斑(senile plaques, SPs)、神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles, NFFs)、神经元及突触丢失。神经元进行性减少是AD的重要病理特征,其中,细胞凋亡起了主导作用。凋亡是程序性的细胞死亡过程,外源性死亡受体途径、内源性线粒体凋亡通路以及内质网应激介导的细胞凋亡过程目前是公认的细胞凋亡的主要通路,近年来研究发现内质网应激性凋亡途径在多种疾病如糖尿病、脑梗塞、阿尔茨海默病的发病中扮演了重要角色,我们以往研究提示AGEs参与APP异常代谢及Aβ的生成,而内质网是生成Aβ1-42的主要场所,在APP的代谢中起着重要作用。内质网内蛋白质折叠功能障碍、钙平衡的破坏及氧化反应的异常等都会触发内质网应激(ERS)。AGEs是否通过触发氧化应激及内质网应激进而导致细胞凋亡参与AD发生发展尚不清楚,为此,我们设计该课题,选择非常接近正常神经细胞形态及生理功能的人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,以此为研究对象,以非酶糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin, AGE-BSA)处理细胞,并分别以抗RAGE中和抗体(RAGE-antibody, RAGE-Ab)、抗氧化剂α-硫辛酸(alpha lipoic acid, ALA)及NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘(diphenyleneiodonium, DPI)预处理细胞探讨AGEs是否通过氧化应激、内质网应激促进细胞凋亡,揭示AGEs参与阿尔茨海默病发生发展的可能相关机制。目的本实验通过研究AGEs对体外培养的SH-SY5Y细胞凋亡的影响及氧化应激和内质网应激在该过程中的作用,探讨AGEs参与AD发生发展的可能机制。方法选择体外培养的SH-SY5Y细胞为模型,分别以不同浓度(0、50、100、200、300μg/mL)的糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-BSA)处理SH-SY5Y细胞48h,选取AGE-BSA敏感浓度200μg/mL处理细胞不同时间(24、36、48h),流式细胞仪(FCM)分别检测各组细胞凋亡率,确定AGE-BSA诱导SH-SY5Y凋亡最佳浓度及时间；将细胞随机分为6组：正常对照组、BSA对照组(200μg/mL BSA)、AGE-BSA组(200μg/mLAGE-BSA)、AGE-BSA+RAGE-Ab组：预先用抗RAGE-Ab (10μg/mL)干预细胞1h,再加入AGE-BSA (200μg/mL); AGE-BSA+ALA组：预先用ALA(终浓度200μmol/L)干预细胞1h,再加入AGE-BSA(200gg/mL)；AGE-BSA+DPI组：先加DPI(30nmo1/L)干预1h,加入AGE-BSA(200gg/mL)。处理48h后FCM检测各组细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞核形态变化；应用活性氧荧光探针DCFH-DA检测AGE-BSA干预SH-SY5Y细胞不同时间(0、12、24、48h)后活性氧(ROS)水平,及不同药物处理48h后细胞ROS水平；通过免疫细胞荧光化学及免疫蛋白印迹方法观察AGEs处理细胞不同时间(0、12、24、48h)后GRP78、p-eIF2α、Caspase-12的蛋白表达情况；选取各蛋白表达高峰时间点,应用免疫蛋白印迹方法检测各不同处理组SH-SY5Y细胞内GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表达变化。结果1.FCM测细胞凋亡率1.1正常细胞凋亡率为(2.23±0.08)%,50、100、200、300μg/mLAGE-BSA作用48h后凋亡率分别为(2.98±0.67)%、(8.23±0.42)%、(16.8±1.27)%、(19.6±2.89)%；200μg/mL AGE-BSA作用24、36、48h后凋亡率分别为(7.54±1.08)%、(10.75±1.19)%、(16.8±1.27)%,提示AGE-BSA能诱导细胞凋亡,且凋亡率随AGE-BSA浓度增加及时间延长而增高。1.2分别用RAGE中和抗体、ALA、DPI预处理细胞后再加入AGE-BSA200μg/mL作用48h,细胞凋亡率分别为(5.18±0.16)%、(5.94±0.10)%、(7.26±1.22)%,与AGE-BSA组相比凋亡率分别下降69.1%、64.6%、56.8%,差异显著(P<0.01或P<0.05),BSA对照组与正常对照组比较差异无统计学意义。2. Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞核形态：不同处理组细胞经Hoechst33258染色在荧光显微镜下观察形态,正常对照组和BSA对照组细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光,无核浓聚,AGE-BSA组可见大量散在凋亡样改变的细胞核,表现为亮蓝色,出现核碎裂,荧光强度比正常细胞明显增强,抗RAGE-Ab、ALA、DPI预处理组均可见细胞荧光强度比AGE-BSA组降低,凋亡细胞数明显减少。3. DCFH-DA检测SH-SY5Y细胞ROS水平3.1AGE-BSA干预0h的细胞内仅有少量ROS, AGE-BSA干预细胞12h可见细胞内ROS水平显著升高,接近0h组细胞的4倍,并且随AGE-BSA作用时间的延长,ROS水平不断增高,与0h组细胞比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3.2AGE-BSA及不同预处理48h检测ROS水平：与正常组比较,AGE-BSA组细胞内ROS明显增多(P<0.01),是正常组的6.95倍,而NC组与BSA对照组比较无显著差异,RAGE-Ab组、ALA组、DPI组细胞内ROS水平较AGE-BSA组分别下降56.2%、46.5%、54.3%,差异均有统计学意义(P<0.01),提示AGEs可能通过与其受体RAGE结合进而激活NADPH氧化酶促进ROS的产生。4.免疫细胞荧光化学及免疫蛋白印迹方法观察SH-SY5Y细胞中的GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表达并进行半定量分析4.1免疫细胞荧光化学方法观察GRP78、p-eIF2α、Caspase-12在SH-SY5Y细胞的表达,AGE-BSA处理后荧光染色阳性细胞数明显增多,GRP78主要在胞浆表达,而p-eIF2α全细胞都有表达,但胞核荧光强度更高,免疫蛋白印迹方法结果显示AGE-BSA分别处理细胞0、12、24、48h, GRP78、p-eIF2α、 Caspase-12蛋白表达水平呈时间依赖性增高,GRP78、p-eIF2α在AGEs处理24h后出现表达峰值,Caspase-12在48h出现表达高峰。4.2按分组要求给予细胞不同处理24h,免疫蛋白印迹结果提示AGEs组GRP78、p-eIF2α蛋白表达水平分别为正常对照组的3.56倍、6.39倍,而预先用抗RAGE-Ab、DPI、ALA分别处理细胞可以显著降低GRP78、p-eIF2α的表达,GRP78下降率分别为39.5%、14.1%、19.3%,p-eIF2α下降率分别为28%、41%、33%,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。处理48h后检测Caspase-12蛋白表达水平,Caspase-12在正常细胞和BSA组弱表达,AGE-BSA乍用于细胞可上调Caspase-12蛋白表达,与正常组和BSA组比较差异均有显著性(P<0.01),而应用抗RAGE-Ab、ALA和DPI分别预处理细胞均可部分阻断AGE-BSA导致的Caspase-12上调,下降率分别为35.9%、43.7%、50.5%,差异显著(P<0.01)。结论1. AGEs通过与其受体RAGE结合,进而激活SH-SY5Y的NADPH氧化酶促进促进ROS产生。2. AGEs可能通过促进ROS的产生引发GRP78表达增加及PERK-eIF2a途径的内质网应激,进而诱导神经细胞凋亡,参与AD的发病。3.阻断AGEs的受体RAGE及DPI、α-硫辛酸抗氧化干预能通过降低氧化应激及内质网应激减少神经细胞凋亡,可望成为防治AD的新的治疗靶点。